張九國(guó) 袁智勇

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院放射治療科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心300060

0 引 言

目前，肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)顯示，2020年男性和女性肺癌患者的死亡人數(shù)均位列所有腫瘤的第一位[1]?？梢?，肺癌惡性度很高。肺腺癌是發(fā)病率最高的肺癌類型之一，肺腺癌是肺小細(xì)胞癌的主要亞型，約占肺癌病例數(shù)的45%[2]。與肺鱗癌不同，肺腺癌起源于支氣管上皮，其發(fā)病率低于肺鱗癌[3]。近年來(lái)，肺腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，且多數(shù)患者確診患肺腺癌時(shí)即為晚期[4]。目前，肺腺癌的靶向治療主要是圍繞表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，GFR）突變和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合的基因畸變，針對(duì)這些基因畸變的個(gè)體化治療已成為標(biāo)準(zhǔn)治療方法[5]。但是，靶向治療后會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致病情急轉(zhuǎn)直下。因此，尋找新的生物標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)以提高肺腺癌的早期診斷率和治療效果迫在眉睫。

母胚亮氨酸拉鏈激酶 (maternal embryonic leucine zipper kinase，MELK)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，屬于磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）相關(guān)絲氨酸蘇氨酸激酶家族，該家族主要參與細(xì)胞周期調(diào)控、干細(xì)胞自我更新、凋亡和剪接調(diào)控等過(guò)程。它的初次鑒定可追溯到非洲爪蟾卵母細(xì)胞和胚胎[6]。MELK定位于染色體9p13.2，并且被證實(shí)在多種腫瘤組織中表達(dá)異常上調(diào)[7]。在部分腫瘤中,叉頭框盒白M1(forkhead box M1,FoxM1)，MYC原癌基因及其家族MYCN轉(zhuǎn)錄因子是導(dǎo)致MELK在癌癥中高表達(dá)的因素[7-10]。但MELK在肺腺癌中的具體機(jī)制仍不清楚。國(guó)內(nèi)關(guān)于MELK在肺腺癌中的研究鮮有報(bào)道。值得一提的是，有文獻(xiàn)報(bào)道了MELK在肺腺癌中高表達(dá)，其中通過(guò)篩選尋找出了MELK[11]，其結(jié)果與本研究相似，但并未通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究利用生物信息學(xué)方法分析MELK與肺腺癌的關(guān)系，并使用免疫組化法驗(yàn)證其在組織中的表達(dá)情況，屬于獨(dú)立自主的研究。

本研究旨在探究MELK在肺腺癌組織中表達(dá)情況，以及MELK的表達(dá)對(duì)肺腺癌患者的臨床預(yù)后的影響，探求MELK作為肺腺癌潛在生物標(biāo)記物和可能治療靶點(diǎn)的可能性，以期為肺腺癌早期診斷、靶向治療以及預(yù)后檢測(cè)等提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014年7月至2019年7月，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的肺腺癌患者70例，年齡（52.70±6.87）歲。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證，患者術(shù)前均未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤分化級(jí)別、原發(fā)灶-淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis，TNM）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。腫瘤分期根據(jù)2010年第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)聯(lián)合制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后的所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，所有患者均已簽署知情同意書，本研究涉及的所有患者資料及標(biāo)本采集工作均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要材料與儀器

組化抗體Anti-MELK抗體、免疫組化生物素二抗（美國(guó)ThermoFisher公司），二氨聯(lián)苯胺（diamiobenzidine，DAB）顯色試劑盒（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法

收集的組織標(biāo)本首先通過(guò)福爾馬林固定，再經(jīng)石蠟包埋。石蠟標(biāo)本在5℃下切片，在然后在65℃下烘烤40 min進(jìn)行脫蠟。切片在磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中洗滌3次，每次2 min。將切片放入枸櫞酸緩沖液中，將抗原放入微波爐中還原（高火5 min，中火10 min）。然后除去多余的水，將H2O2滴在濕的盒子中15 min，用PBS緩沖液清洗2 min，重復(fù)3次。切片用4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）溶液固定25 min，然后用2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液在PBS中室溫封閉20 min。切片用抗MELK抗體稀釋（1∶50~1∶500），4℃孵育過(guò)夜。切片在結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶（h orseradish peroxidase，HR P）的生物素二抗中孵育，然后用DAB試劑盒進(jìn)行染色反應(yīng)。最后用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

每例患者的腫瘤組織及癌旁組織切片選取3個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采用雙盲法判斷，組織切片中MELK的染色水平評(píng)定分為陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度兩項(xiàng)參數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)為0%時(shí)，記0分；1%~33%時(shí)，記1分；33%~66%時(shí)，記2分；＞66%時(shí)，記3分。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色記0分；低度染色記1分；中度染色記2分；中高度染色記3分。以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積判斷表達(dá)情況，計(jì)分范圍為0~9分。結(jié)果＜1，記0分。1~3分為MELK低表達(dá)；4~9分為MELK高表達(dá)。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profilinginteractive analysis，GEPIA）進(jìn)行生物信息分析。差異基因的閾值為P＜0.05，log2FC＞1或＜-1，其中FC（fold change）為兩組間表達(dá)量的比值。同時(shí)，以中位數(shù)作為Kaplan-Meier生存分析的基礎(chǔ)，用虛線標(biāo)記95%置信區(qū)間。

利用GEPIA（http://gepia.cancer pku.cn/detail.php?gene=melk/）分析MELK在肺腺癌和正常組織中的表達(dá)情況，以及肺腺癌組中MELK高表達(dá)、MELK低表達(dá)組與總體生存率和無(wú)病生存率之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 8.0軟件處理數(shù)據(jù)，定量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組數(shù)據(jù)比較時(shí)，采用t檢驗(yàn)分析；分析臨床病理特征與MELK表達(dá)之間的相關(guān)性時(shí)，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中MELK的生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了483例肺腺癌組織和347名例癌旁正常組織，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，MELK的mRNA表達(dá)在肺腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 肺腺癌組織和正常組織中母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）的mRNA表達(dá)

此外，通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析探討了MELK的表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的潛在關(guān)聯(lián)，共分析了476例（總生存率）和240例（無(wú)病生存率）資料。結(jié)果表明，MELK高表達(dá)組的總生存率和無(wú)病生存率均明顯低于低表達(dá)組（均P＜0.05）（圖2）。上述結(jié)果提示，MELK的表達(dá)與患者的預(yù)后顯著相關(guān)。

圖2 MELK表達(dá)與肺腺癌患者生存率的相關(guān)性

2.2 MELK在肺腺癌組織中的表達(dá)

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了70例經(jīng)手術(shù)切除治療的肺腺癌患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中MELK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，肺腺癌中的MELK的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。根據(jù)染色的強(qiáng)度，將肺腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)MELK在癌旁正常肺組織中的表達(dá)量顯著降低（圖3）。以上結(jié)果均說(shuō)明，MELK在肺腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。

圖3 肺腺癌組織和癌旁正常組織中母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）的免疫組化結(jié)果

2.3 MELK蛋白表達(dá)與肺腺癌患者的臨床病理特征相關(guān)性

為了進(jìn)一步明確MELK在肺腺癌患者中的臨床意義，分析比較了MELK與肺腺癌的臨床病理特征之間的相關(guān)性。比較了MELK低表達(dá)組與高表達(dá)組肺腺癌患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，MELK的表達(dá)水平與肺腺癌患者的腫瘤大?。≒=0.015）、腫瘤分期（P=0.006）顯著相關(guān)，而與年齡、性別、吸煙情況、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（表1）

表1 母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）蛋白表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

肺腺癌是肺癌中非小細(xì)胞型肺癌的主要亞型。目前基因表達(dá)譜分析已被廣泛用于鑒定和預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后和生存的分子標(biāo)志物。但遺憾的是，對(duì)與特定生存相關(guān)的關(guān)鍵基因的知識(shí)仍然非常有限[12]。尋找新的生物標(biāo)記物進(jìn)行早期診斷，并針對(duì)特定腫瘤找到潛在的治療靶點(diǎn)已成為當(dāng)今一大研究熱點(diǎn)。1997年，研究者首次克隆了MELK cDNA，所克隆的激酶中還包含亮氨酸拉鏈基序，因此該激酶被稱為母胚胎亮氨酸拉鏈激酶（MELK）[13]。自此，針對(duì)MELK的研究拉開序幕。

目前，多項(xiàng)研究結(jié)果表明MELK在多種腫瘤中高度表達(dá)，包括腎癌、肝內(nèi)膽管癌。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)MELK在Ⅳ期晚期透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本中上調(diào)，并且MELK的上調(diào)與晚期疾病狀態(tài)顯著相關(guān)。Cigliano等[15]證實(shí)了MELK在肝癌腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的非腫瘤組織，且MELK的高水平與患者的短生存期有關(guān)。Maes等[16]發(fā)現(xiàn)MELK在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤組織中高表達(dá)，且與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤較差的臨床結(jié)果相關(guān)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示MELK與腫瘤大小、腫瘤分期都具有明顯的相關(guān)性，而免疫組化染色結(jié)果顯示MELK蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。上述結(jié)果提示，MELK在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后生存息息相關(guān)。

本研究結(jié)果初步證實(shí)了MELK與肺腺癌之間的關(guān)系，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)探究。研究者對(duì)MELK在其他腫瘤中的機(jī)制開展了大量研究。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼RNA LINC02418在結(jié)直腸癌中顯著過(guò)表達(dá)，LINC02418通過(guò)吸收miR-1273g-3p充當(dāng)ceRNA來(lái)上調(diào)MELK表達(dá)，LINC02418-miR-1273g-3p-MELK軸在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。對(duì)于MELK與肺腺癌的關(guān)系，Tang等[18]初步證實(shí)了MELK通過(guò)介導(dǎo)Slug、Twist1、基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）、N-catenin和E-catenin的表達(dá)介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通過(guò)PLK1-CDC25C-CDK1途徑調(diào)節(jié)G2/M期，參與抑制細(xì)胞凋亡。但是，在細(xì)胞凋亡方面，MELK與肺腺癌的機(jī)制目前仍尚不明晰。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)了MELK與肺腺癌之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探究MELK成為肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物和可能的治療靶點(diǎn)提供了一些思路。本研究采集的病理樣本共70例，樣本量不大，可能存在結(jié)果偏倚，下一步將構(gòu)建生物模型并開展相關(guān)生物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究MELK在肺腺癌中的作用，包括相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因表達(dá)改變等，以期揭示MELK在肺腺癌中的具體機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突