韓雨薇 王晨辰 李曉明

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110016

0 引言

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種危及生命的腦血管疾病，患者預(yù)后極差。早期腦損傷被認(rèn)為是SAH預(yù)后不良的主要原因，諸多研究結(jié)果表明炎癥在該過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。

高遷移率族蛋白1（high-mobility group box 1，HMGB1）是一種經(jīng)典的損傷相關(guān)分子，在彎曲DNA、穩(wěn)定核小體形成和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面起著關(guān)鍵作用[2]。在病理狀態(tài)下，HMGB1可由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放，也可由免疫細(xì)胞或非免疫實(shí)質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)分泌。文獻(xiàn)報(bào)道HMGB1水平顯著上調(diào)，并與SAH不良預(yù)后和病死率相關(guān)[3]，且SAH后引發(fā)炎癥進(jìn)而導(dǎo)致早期腦損傷的發(fā)生發(fā)展。

沉默調(diào)節(jié)蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的脫乙?；?，也是SIRT家族中研究最多的脫乙?；钢弧Ｔ谀摱景Y條件下，SIRT1可通過抑制HMGB1乙?；M(jìn)而抑制HMGB1的細(xì)胞外釋放。已有研究結(jié)果證實(shí)可通過HMGB1中賴氨酸的脫乙?；瘉碚{(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4-5]，HMGB1可能是SIRT1的一個(gè)新的去乙?；悬c(diǎn)。

筆者所在課題組前期研究結(jié)果表明五環(huán)三萜類化合物齊墩果酸（oleanolic acid，OA）對SAH后的早期腦損傷具有保護(hù)作用，但作用機(jī)制尚未完全清楚。因此本研究建立了大鼠SAH模型，進(jìn)一步探討OA對SAH后早期腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

OA（純度98%，天津士蘭科技有限公司），兔抗小鼠HMGB1單抗、兔抗小鼠乙?；疕MGB1單抗（美國Cell Signaling Technology公司），山羊抗兔SIRT1單抗（美國Abcam公司），兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白單抗（美國Santa Cruz公司），二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒、5×上樣緩沖液、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Trizol試劑、HMGB1引物（美國Invitgen公司），Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），二甲亞砜、Sirtinol（SIRT1抑制劑）（美國Sigma公司）。健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠176只，體質(zhì)量范圍200~250 g，購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCX K（遼）2020-0001。飼養(yǎng)條件為溫度18~23℃，相對濕度60%~70%，光照節(jié)律為12 h光照/12 h黑暗，自由進(jìn)食飲水。本研究嚴(yán)格遵守美國國立衛(wèi)生研究院1996年編訂的National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals。

Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司），TY-80R脫色搖床（金壇市醫(yī)療儀器廠），Mini Protean 3 Cell全濕法電轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、CFX96Touch熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Axiovert 40熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），Z-323K冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 SAH大鼠模型的建立

大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，暴露左側(cè)頸動(dòng)脈及其分支。將鈍化的4-0單絲尼龍縫線從頸外動(dòng)脈刺入頸內(nèi)動(dòng)脈并停止，直至出現(xiàn)阻力。然后穿刺大腦前動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈分叉處造成SAH?？p合后將大鼠置于37℃加熱墊上。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

采用完全隨機(jī)法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）（n=48）、SAH組（n=48）、OA組（n=48）和Sirtinol組（n=32）。SAH組、OA組和Sirtinol組大鼠均按1.2.1節(jié)方法建立SAH模型，Sham組大鼠不實(shí)施穿刺。采用二甲亞砜溶解OA，注射前以氯化鈉注射液進(jìn)行稀釋（二甲基亞砜終體積分?jǐn)?shù)為10%）[6]。造模后1 h，OA組大鼠腹腔注射OA（20 mg/kg），Sirtinol組大鼠側(cè)腦室注射Sirtinol（2 mmol/L，30μL/kg）[5]，Sham組和SAH組大鼠均注射等體積的氯化鈉注射液。

1.2.3 SAH評分和Garcia評分

SAH后24 h采用SAH分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評估SAH的嚴(yán)重程度[7]?；壮胤譃?部分，每部分根據(jù)出血量從0~3進(jìn)行評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：3分，血塊覆蓋所有動(dòng)脈；2分，中等血流量，可見動(dòng)脈；1分，極少量SAH；0分，無SAH。同時(shí)，根據(jù)改良的Garcia評分標(biāo)準(zhǔn)評估SAH后24 h大鼠的神經(jīng)功能，包括對自主運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、身體活動(dòng)和軀體感覺的評估。分別對觸覺反應(yīng)、肢體對稱性、身體本體感覺、攀登、自發(fā)活動(dòng)和前肢伸展這6項(xiàng)測試進(jìn)行評分，并計(jì)算總分，總分范圍為3~18分。由一名獨(dú)立的觀察員進(jìn)行上述所有評分。

1.2.4 腦組織含水量檢測

SAH后24 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠實(shí)施安樂死，取左右半球腦組織，立即稱質(zhì)量（濕重），然后放入105℃烤箱中烘干72 h，再稱量腦組織質(zhì)量（干重）。按照下式計(jì)算腦組織含水量[8]

腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%

1.2.5 伊文思藍(lán)染色

SAH后24 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠實(shí)施麻醉，左股靜脈注射伊文思藍(lán)染料（20 g/L，5 mL/kg）；循環(huán)1 h后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液灌流；取大鼠左右半球腦組織，稱質(zhì)量后置于甲酰胺溶液中，60℃恒溫孵育24 h；收集浸出液，采用酶標(biāo)儀測定浸出液于620 nm處的吸光度值[9]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法

SAH后24 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠，取大鼠腦組織于冰上加入RIPA裂解液提取蛋白，4℃、12000×g離心10 min，取上清，采用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；每組取60μg蛋白，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后加入質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白，室溫封閉1 h；分別加入山羊抗兔SIRT1單抗、兔抗小鼠HMGB1單抗、兔抗小鼠乙?；疕MGB1單抗和兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白單抗，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h；經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影、定影后對X射線膠片進(jìn)行掃描，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

SAH后24 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠取腦組織。按照Trizol試劑說明書提取大鼠腦組織總RNA。用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。HMGB1正向引物為5′-TCCTTCGGCCTTCTTCTTGT-3′，反向引物為5′-CGGCCTTCTTTTCATAGGGC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.8 免疫熒光染色

SAH后24 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠，先以氯化鈉注射液灌注，再以質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛溶液灌注固定腦組織。取腦組織浸泡于40 g/L的多聚甲醛溶液中過夜，依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度為4 mm）。在切片上滴加兔抗小鼠HMGB1單抗，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；滴加異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G（H＋L）抗體，室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.9 TUNEL染色

SAH后24 h，每組取8只大鼠，按1.2.8節(jié)方法制作腦組織切片。采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測腦組織切片中的凋亡細(xì)胞，具體方法參照試劑盒說明書，染色后置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，然后通過Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA對神經(jīng)功能障礙和血腦屏障的影響

如圖1A所示，SAH組SAH評分明顯高于Sham組（P＜0.001），OA給藥后SAH評分明顯降低（P＜0.001），出血情況減輕；與OA組相比，Sirtinol組SAH評分升高（P＜0.01），出血情況加重。另外，OA能明顯提高Garcia評分（P＜0.01），改善神經(jīng)功能；而Sirtinol組較OA組Garcia評分明顯降低（P＜0.001），神經(jīng)功能障礙加重（圖1B）。筆者進(jìn)一步檢測了大鼠腦組織含水量和伊文思藍(lán)滲出率，結(jié)果顯示與SAH組相比，OA給藥能明顯降低腦組織含水量和伊文思藍(lán)滲出率（均P＜0.01）；與OA組相比，Sirtinol能增加腦組織含水量和伊文思藍(lán)滲出率（均P＜0.01）（圖1C、1D），提示OA具有改善SAH后腦血管屏障的作用，而抑制SIRT1則可加重血管屏障損傷。

圖1 SAH后24 h OA對大鼠SAH評分、Garcia評分、腦組織含水量和依文思藍(lán)滲出的影響

2.2 OA對HMGB1表達(dá)與分布的影響

HMGB1的核質(zhì)轉(zhuǎn)移和釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，因此筆者進(jìn)一步檢測了大鼠腦組織中HMGB1的表達(dá)與分布。蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，SAH后HMGB1蛋白和mRNA水平均明顯升高（P＜0.001，P＜0.01），而OA能明顯抑制HMGB1蛋白和mRNA水平（P＜0.01，P＜0.05）（圖2）。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sham組中HMGB1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中；與Sham組相比，SAH術(shù)后HMGB1蛋白由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，而OA給藥后可抑制HMGB1蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)移（圖3）。上述結(jié)果提示，OA能降低HMGB1的表達(dá)并抑制其核質(zhì)轉(zhuǎn)移，從而減少HMGB1向細(xì)胞外釋放。

圖2 SAH后24 h OA對大鼠腦組織中HMGB1蛋白和mRNA水平的影響

圖3 熒光顯微鏡觀察SAH后24 h OA對大鼠腦組織中HMGB1蛋白分布的影響（免疫熒光染色，×400）

2.3 OA對SIRT1介導(dǎo)的HMGB1去乙?；挠绊?/h3>

乙?；瘜MGB1核質(zhì)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞外分泌具有至關(guān)重要的作用。SIRT1可通過保持HMGB1處于去乙酰化（非活性）狀態(tài)來抑制HMGB1的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞外分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)。因此，筆者接著檢測了大鼠腦組織中SIRT1和乙?；疕MGB1蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與SAH組相比，OA組SIRT1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.001），乙?；疕MGB1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；而與OA組相比，Sirtinol組SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），乙酰化HMGB1蛋白表達(dá)升高（P＜0.001）（圖4）。該結(jié)果提示，OA能通過上調(diào)SIRT1抑制乙?；疕MGB1蛋白的表達(dá)從而減輕炎癥反應(yīng)。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測SAH后24 h OA對大鼠腦組織中SIRT1和乙?；疕MGB1蛋白表達(dá)的影響

2.4 OA對神經(jīng)元調(diào)亡的影響

TUNEL和NeuN雙染結(jié)果如圖5所示，Sham組僅見少量TUNEL陽性細(xì)胞；SAH組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于Sham組，而OA給藥后能有效減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量；與OA組相比，SIRT1抑制劑Sirtinol可明顯增加TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。上述結(jié)果提示，OA具有抑制神經(jīng)元調(diào)亡的作用。

圖5 熒光顯微鏡觀察SAH后24 h OA對大鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡的影響（TUNEL和NeuN雙染，×400）

3 討論與結(jié)論

雖然SAH的發(fā)病率僅占卒中的5%，但其病死率高（40%）、發(fā)病年齡較早（45~55歲），給患者家庭和社會(huì)帶來了巨大負(fù)擔(dān)[10]。HMGB1被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要成分[2，11]。HMGB1的移位和分泌是其誘導(dǎo)炎癥的重要步驟[12]。HMGB1可被轉(zhuǎn)錄后修飾，主要通過兩個(gè)核定位位點(diǎn)的賴氨酸乙?；瘉碛绊懫湓诩?xì)胞中的定位[13]。免疫細(xì)胞被刺激后，高乙?；閷?dǎo)的HMGB1核質(zhì)轉(zhuǎn)移和HMGB1的主動(dòng)釋放發(fā)生[14]。主動(dòng)釋放的HMGB1能反過來刺激宿主細(xì)胞本身和鄰近細(xì)胞，發(fā)揮自分泌和旁分泌作用，從而導(dǎo)致炎癥的放大和炎癥損傷的發(fā)生[15]。釋放細(xì)胞外的HMGB1通過MyD88途徑和非MyD88依賴途徑激活多種細(xì)胞表面受體，包括晚期糖基化終產(chǎn)物、Toll樣受體和趨化因子受體4[16]。隨后這些通路直接通過核因子κB途徑或間接通過磷脂酰肌醇-3-激酶或絲裂原活化蛋白激酶途徑觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)。HMGB1轉(zhuǎn)位和釋放被認(rèn)為在SAH中起著關(guān)鍵作用[3，17]。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在SAH后給予OA治療明顯降低了HMGB1在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)并限制其于細(xì)胞核中，表明OA抑制了HMGB1的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)，SAH后HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)主要發(fā)生于神經(jīng)元細(xì)胞中。而Murakami等[18]報(bào)道，SAH兔模型腦組織中超過90%的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)HMGB1。顯然，這與本研究的研究結(jié)果不同，這種差異可能是由于筆者選取的研究時(shí)間點(diǎn)為SAH后的24 h，而Murakami等[18]的分析時(shí)間點(diǎn)分別為SAH后的第2天和第5天。這表明HMGB1在SAH后的早期腦損傷和遲發(fā)性腦損傷中起著不同作用：在早期腦損傷中，HMGB1主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞，并與細(xì)胞凋亡有關(guān)；在遲發(fā)性腦損傷中，HMGB1主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，與免疫激活有關(guān)。這是一個(gè)有趣且有價(jià)值的問題，值得進(jìn)一步研究。

SIRT是一個(gè)高度保守的脫乙酰酶家族，需要NAD+作為脫乙?；磻?yīng)的輔助因子[19]。文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1能調(diào)控乙?；疕MGB1的表達(dá)[20]，且SIRT1活化對SAH后的腦損傷具有保護(hù)作用[5]。與其他促炎細(xì)胞因子不同，HMGB1為一種晚期反應(yīng)性炎癥介質(zhì)，在SAH后約20 h達(dá)到分泌高峰[21]。因此，本研究觀察了SAH后24 h OA對大鼠SIRT1的表達(dá)及HMGB1乙?；鸵孜坏挠绊憽Ｑ芯拷Y(jié)果顯示，OA明顯增加了SIRT1蛋白的表達(dá)，表明OA在SAH大鼠模型中作為SIRT1的激活劑減少了HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的釋放，從而減輕了SAH后的早期腦損傷。

本研究結(jié)果表明，OA對SAH后的早期腦損傷具有顯著的保護(hù)作用。OA可通過抑制HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，從而抑制HMGB1向細(xì)胞外分泌。這種保護(hù)作用主要是由于OA激活了SIRT1進(jìn)而增加了HMGB1的乙?；Ｌ烊换衔颫A有望作為SIRT1激活劑用于SAH后早期腦損傷的治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突