林愛金，王潔瓊，敖麗娟，陳茉弦

昆明醫(yī)科大學(xué)康復(fù)學(xué)院，云南昆明市 650500；

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)由圍產(chǎn)期缺血、缺氧引起，是導(dǎo)致新生兒腦損傷死亡或神經(jīng)功能損害的最重要原因[1-2]，帶來嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、癲癇、孤獨癥和智力障礙等[3]。動物行為學(xué)評價已作為較為可靠的手段應(yīng)用于HIBD 模型，但主要集中于早期，且結(jié)論不一。本研究探討腦損傷模型小鼠遠期行為的變化，主要涉及運動、情緒和學(xué)習(xí)記憶。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠50 只，10 日齡，雌雄不限，體質(zhì)量3.85～4.50 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物實驗許可證號SCXK(滇)K2015-0002。室溫(23±2)℃飼養(yǎng)，光照12 h(7:00 a.m.～7:00 p.m.)，自由飲食水。

1.2 試驗器材

1.2.1 明暗穿梭箱

由塑料板圍成40×40×35 cm 箱體，明箱底部和四壁均為白色，暗箱底部和四壁均為黑色，由一面40×35 cm的墻分隔，墻的底部中心有7×7 cm開口。

1.2.2 高架十字迷宮

由黑色木板圍成兩個開臂和兩個閉臂，“十”字型擺放，臂底35×5 cm，閉臂墻高15 cm，開臂邊緣由0.5×0.5 cm 的方塊包圍，距地面100 cm；中央平臺為5×5cm正方形。

1.2.3 新事物試驗箱

由透明塑料板圍成50×50×50 cm 的正方形箱體，周圍用黑布環(huán)繞。

1.2.4 Y迷宮實驗

30×8×10 cm 迷宮臂3 個，相互間夾角120°。攝像機置于臂上方1.5 m，記錄小鼠活動，Supermaze 分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司)分析。

1.3 動物分組及造模

小鼠分為對照組(n=20)和HIBD 組(n=30)。HIBD 組異氟烷25 μl 吸入麻醉，固定于無菌動物手術(shù)臺，頸部切口5～10 mm，分離左頸總動脈；5-0 絲線雙重結(jié)扎左頸總動脈后離斷，縫合傷口。手術(shù)操作控制在10 min內(nèi)。

術(shù)后，小鼠置于帶有母鼠氣味的墊料上休息30 min，之后轉(zhuǎn)移到母鼠旁休息1 h，再置于含8% O2和92%N2混合氣體的34 ℃恒溫缺氧箱中45 min。

對照組僅切開左頸部皮膚，暴露頸總動脈，不結(jié)扎，直接縫合傷口。

造模結(jié)束后放回母鼠身邊自由飲食。

1.4 模型評價

于術(shù)后1 d 和3 d 行神經(jīng)行為學(xué)評估，術(shù)后3 d 各組取3只小鼠行TTC染色，評估模型是否成功。

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評估

采用Longa 評分法：0 分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1 分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2 分，先癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，對側(cè)傾倒；4 分，行走困難、意識喪失。評分1～3分進入實驗。

評定者對分組不知情，重復(fù)評估3次，取平均值。

1.4.2 TTC染色

每組取3 只小鼠，麻醉后斷頭取腦，肉眼觀察腦組織大體形態(tài)變化。對照組左右大腦半球?qū)ΨQ，體積未增大，未出現(xiàn)病理變化；模型組左腦組織輕微水腫，體積稍大于右側(cè)，出現(xiàn)梗死灶，呈蒼白色。見圖1。

圖1 兩組大體觀察

腦組織于-20 ℃冰箱中冰凍20 min 后，冠狀切片，厚2 mm，置2%TTC 溶液中，37 ℃恒溫30 min，4%多聚甲醛固定，拍照。結(jié)果與肉眼觀察相似。見圖2。

圖2 兩組TTC染色

造模過程中，結(jié)扎過程死亡2 只，缺氧過程死亡3 只；造模后，Longa 評分0 分2 只，未出現(xiàn)梗死灶4只。最終造模成功19只，進入后續(xù)實驗。

1.5 行為學(xué)實驗

小鼠于出生后2 個月行行為學(xué)實驗，期間無小鼠死亡。實驗開始前，小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d。

1.5.1 運動功能

采用懸吊試驗。鐵絲水平，距桌面50 cm，小鼠前爪抓握鐵絲，記錄小鼠懸吊時間。評分標準：1分，≤10 s；2 分，＞10～30 s；3 分，＞30～120 s；4 分，＞2～5 min；5分，＞5 min。

1.5.2 情緒

1.5.2.1 明暗箱試驗

小鼠從明箱放入，自由活動5 min，記錄潛伏期、明箱累積時間和進入明箱次數(shù)。

1.5.2.2 高架十字迷宮

將小鼠從中央?yún)^(qū)放入，頭朝向開放臂，自由活動5 min，記錄小鼠在中心區(qū)、開/閉臂停留時間以及進入開/閉臂的次數(shù)。

1.5.3 學(xué)習(xí)和記憶功能

1.5.3.1 物體識別試驗

新事物試驗箱左上角和右上角各放置一個形狀大小相同的長方形物體；將小鼠從下墻中央放入，自由活動10 min；取出小鼠休息1 h；箱內(nèi)一個長方體改為一個大小相似的圓柱體；小鼠同一位置放入，自由活動5 min。記錄后5 min 內(nèi)小鼠在新、舊物體旁停留時間，計算物體識別指數(shù)。

1.5.3.2 Y迷宮

先將一臂用擋板擋住(新異臂)，小鼠從其他任一臂進入(起始臂)，自由活動10 min。取出小鼠休息1 h。移除新異臂擋板，小鼠從起始臂進入，自由活動5 min，記錄在三個臂的停留時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 運動功能

HIBD 組懸吊試驗評分(2.4±0.62)分，低于對照組的(3.0±0.58)分(t=2.785,P=0.01)。

2.2 情緒

2.2.1 明暗箱試驗

HIBD 組潛伏期顯著長于對照組(P＜0.001)，明箱累積時間和穿入明箱次數(shù)少于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組明暗箱試驗結(jié)果比較

2.2.2 高架十字迷宮

HIBD 組開臂停留時間顯著短于對照組(P＜0.001)，閉臂停留時間明顯長于對照組(P＜0.01)。見表2。

表2 兩組高架十字迷宮試驗結(jié)果比較

2.3 學(xué)習(xí)和記憶功能

2.3.1 物體識別試驗

HIBD 組舊事物停留時間長于對照組(P＜0.05)，物體識別指數(shù)低于對照組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組別新物體識別試驗結(jié)果比較

2.3.2 Y迷宮

HIBD 組起始臂停留時間短于對照組(P＜0.05)，新異臂停留時間短于對照組(P＜0.05)。見表4。

表4 各組別Y迷宮試驗結(jié)果比較(s)

3 討論

圍產(chǎn)期缺氧、缺血導(dǎo)致新生兒死亡或殘疾是一個重要的臨床問題。每年早產(chǎn)并發(fā)癥占全球新生兒死亡的29%，其中3%導(dǎo)致終生殘疾[4]。新生兒HIBD 最常用的實驗?zāi)Ｐ陀蒖ice 等[5]于1981 年首次提出，即單側(cè)頸動脈結(jié)扎后暴露于低氧環(huán)境中一段時間，根據(jù)缺氧暴露的持續(xù)時間，可誘導(dǎo)輕、中、重度損傷，模型利用出生7～12 d 幼鼠復(fù)制，約相當(dāng)于人類妊娠36～40周。C57BL/6 小鼠對缺氧、缺血損傷特別敏感，適合研究新生兒腦損傷[6]。許多針對缺氧缺血性腦病的研究用出生10 d的小鼠[7-8]。

新生兒腦損傷與皮質(zhì)下白質(zhì)和灰質(zhì)損傷、結(jié)構(gòu)連接受損有關(guān)[9]，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙[10]。由于海馬、紋狀體和皮質(zhì)損傷，發(fā)育早期和晚期會出現(xiàn)焦慮相關(guān)行為和認知障礙，以及運動協(xié)調(diào)障礙[11]。腦缺氧、缺血會導(dǎo)致細胞代謝、發(fā)育和結(jié)構(gòu)破壞，改變髓鞘形成模式，導(dǎo)致行為障礙[12]。

懸吊試驗用于檢測小鼠的運動能力[13]；明暗箱試驗評價小鼠的自發(fā)活動和探索行為，反映是否存在焦慮、抑郁行為[14]；高架十字迷宮試驗也用于評價小鼠的焦慮和抑郁行為[15]；物體識別試驗[16]和Y 迷宮試驗[17]主要用于評估小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

本研究顯示，新生小鼠發(fā)生HIBD 后，運動、情緒和認知功能損害會持續(xù)到成年。早期診斷和治療至關(guān)重要。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。