丁 玉,宋秀賢,曹西華,俞志明

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 4.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

赤潮是由生活在海水中的藻類大量增殖或聚集造成的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象[1],近年來(lái),赤潮在我國(guó)近海海域頻繁出現(xiàn),對(duì)生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)殖業(yè)等造成嚴(yán)重危害。2000年以前,我國(guó)赤潮發(fā)生次數(shù)和累計(jì)面積相對(duì)較少。自2001年起,赤潮年發(fā)生次數(shù)維持在50次以上,其中,2012年在我國(guó)東南沿海一帶暴發(fā)的米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)赤潮對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了毀滅性的打擊,直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)20億元[2]。

作為全球性的典型海洋生態(tài)災(zāi)害之一,赤潮從多個(gè)方面威脅著人類的生命安全,有關(guān)赤潮治理方法的研究眾多,但大多數(shù)方法因成本、生態(tài)效應(yīng)等問(wèn)題仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段[3]。而改性粘土絮凝法作為一種應(yīng)急處置技術(shù),是目前可現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用的赤潮治理方法,具有操作簡(jiǎn)便、成本節(jié)約、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。改性粘土除藻原理是通過(guò)改性粘土顆粒與赤潮藻細(xì)胞碰撞結(jié)合、發(fā)生絮凝,使赤潮藻細(xì)胞沉降到底層死亡,并對(duì)未絮凝的藻細(xì)胞造成損傷,從而達(dá)到有效消除和控制赤潮的目的[4]。

與赤潮藻自然消亡相比,改性粘土法作為一種重要的赤潮防控手段,可在短時(shí)間內(nèi)迅速沉降大量藻細(xì)胞至底層,絮凝后藻細(xì)胞的消亡分解問(wèn)題一直備受關(guān)注。藻類的消亡分解過(guò)程除了受溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度等因素影響外[5],通常由細(xì)菌介導(dǎo)[6]。目前,關(guān)于細(xì)菌在藻類分解過(guò)程中的影響和作用等已有很多報(bào)道,例如,在分解的微囊藻(Microcystisspp.)細(xì)胞周圍發(fā)現(xiàn)有大量桿菌聚集[7]; 研究還發(fā)現(xiàn)在小球藻(Chlorellasp.)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)分解過(guò)程中異養(yǎng)菌優(yōu)勢(shì)群落從假單胞菌屬-產(chǎn)堿菌屬(Pseudomonas-Alcaligenes)轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)桿菌屬-莫拉菌屬(Acinetobacter-Moraxella)[8]。

改性粘土法的高效絮凝作用使大量藻細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)脫離上層水體進(jìn)入沉積物表面,這些沉積絮體中的藻源有機(jī)質(zhì)可能部分被粘土吸附封存于底層沉積物中,部分被細(xì)菌分解后進(jìn)入水體。因此,改性粘土絮凝赤潮生物過(guò)程中細(xì)菌群落的變化值得關(guān)注與研究。本文通過(guò)室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn),探究典型赤潮生物——米氏凱倫藻在不同改性粘土絮凝后,底層絮體中細(xì)菌變化差異,揭示改性粘土治理赤潮后對(duì)底層環(huán)境中細(xì)菌群落的組成及功能的影響,同時(shí)結(jié)合相關(guān)水質(zhì)參數(shù),初步探討細(xì)菌群落變化與底層絮體中有機(jī)質(zhì)(TOC)含量的關(guān)系,以期進(jìn)一步完善對(duì)改性粘土生態(tài)環(huán)境效應(yīng)的認(rèn)識(shí),為改性粘土治理赤潮的現(xiàn)場(chǎng)工作提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻培養(yǎng)及改性粘土制備

本研究選取我國(guó)近海典型的有毒赤潮藻——米氏凱倫藻為研究對(duì)象。藻種取自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù),在溫度(20±1) ℃、光照強(qiáng)度 50～60 μmol/(m2·s)、光暗比12 h∶12 h條件下進(jìn)行培養(yǎng),后期實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件相同。所有實(shí)驗(yàn)用具經(jīng)過(guò)5%HCl浸泡24 h后,在121 ℃下高溫滅菌30 min。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所用的海水取自青島膠州灣海域,經(jīng)0.45 μm混合纖維膜過(guò)濾、121 ℃高溫滅菌 30 min,冷卻至室溫后,加入無(wú)硅L1營(yíng)養(yǎng)液[9]。

實(shí)驗(yàn)所使用的粘土為廣西北海高嶺土,所采用的改性劑分別為聚合氯化鋁(PAC)和硫酸鋁(AS)。聚合氯化鋁改性粘土(MCⅠ)和硫酸鋁改性粘土(MCⅡ)的制備方法參照文獻(xiàn)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)利用16S rDNA的方法測(cè)定改性粘土的帶菌情況,多次濃縮提取 DNA后,PCR擴(kuò)增均未獲得目的條帶,說(shuō)明改性粘土自帶細(xì)菌量較低; 這可能是改性粘土的制備過(guò)程(包括水洗篩選、磁選凈化、高溫老化等十幾道工藝[4])使得材料本身的細(xì)菌含量較低,故在本文討論中暫不考慮粘土自帶細(xì)菌的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將米氏凱倫藻培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期,混合均勻后分別置于32個(gè)1 L的容器中,藻密度約為(3.08±0.30)×107個(gè)/L。分別加入 MCⅠ和 MCⅡ,使其最終質(zhì)量濃度均為 0.5 g/L,于 3 h(在圖中表示為 1 d)、3 d、5 d、7 d、11 d、16 d、21 d、26 d采集樣品,每組兩個(gè)平行樣。分層取樣,首先,于液面下3 cm處移取藻液10 mL,用于當(dāng)日測(cè)定藻密度,隨后,通過(guò)虹吸法吸出上層液體(940 mL),取其中 40 mL用于溶解態(tài)營(yíng)養(yǎng)鹽(硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽)的測(cè)定,樣品經(jīng)三氯甲烷固定后凍于-20 ℃待分析。剩余50 mL液體與底層絮體充分混勻,15 mL絮體混合液經(jīng)飽和氯化汞固定后儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱,用于測(cè)定總有機(jī)碳(TOC)。30 mL用于測(cè)定 16S rDNA,樣品于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。5 mL樣品經(jīng)多聚甲醛(終濃度為1%)固定后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中,用于細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3 分析方法

1.3.1 細(xì)菌及藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

將凍存的細(xì)菌樣品融化處理后,利用無(wú)菌 TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)緩沖液稀釋100倍(逐級(jí)稀釋)。通過(guò)SYBR Green I染色劑(按照體積比1∶10 000)避光染色 15 min后[12],上流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur,USA)進(jìn)行檢測(cè)[13],利用內(nèi)含數(shù)量已知 Beads的絕對(duì)計(jì)數(shù)管(BD Trucount tubes,USA)確定細(xì)菌濃度,將細(xì)菌在坐標(biāo)軸上圈出來(lái)完成計(jì)數(shù)[14]。藻細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣品用 Lugol試劑固定,在倒置顯微鏡(Olympus IX71,Japan)下進(jìn)行鏡檢細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 16S rDNA

真空抽濾絮體懸濁液于 0.22 μm 的濾膜上,用OMEGA水樣提取試劑盒(D5525),按照使用說(shuō)明書提取總 DNA,使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。將檢測(cè)合格的 DNA樣品送至諾禾致源生物信息科技有限公司,使用16S rDNA通用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和 806R(5′-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增,基于 Ion S5TMXL技術(shù)測(cè)序平臺(tái)(Thermofisher),利用單端測(cè)序(single-end)的方法,完成16S V3-V4區(qū)域測(cè)序分析。

1.3.3 其他水質(zhì)參數(shù)

TOC通過(guò)總有機(jī)碳分析儀(Analytik jena Multi N/C 2100S,Germany)進(jìn)行測(cè)定[15]。營(yíng)養(yǎng)鹽濃度測(cè)定的方法參照《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T 12763.4—2007),銨鹽采用次氯酸鈉-苯酚法,硝酸鹽通過(guò) Cd還原為亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法(重氮-偶氮法)[16],所有營(yíng)養(yǎng)鹽樣品均用營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀(Skalar San++,Netherland)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

改性粘土對(duì)藻細(xì)胞的去除率計(jì)算公式如下:

其中,RE為去除率,N0和Nt分別為添加改性粘土前和取樣時(shí)間t時(shí)刻的藻細(xì)胞數(shù)量。

利用FlowJo軟件(TreeStar,USA)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的讀取和分析。使用 Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Shannon指數(shù)。采用FAPROTAX(Functional Annotation of Prokaryotic Taxa)數(shù)據(jù)庫(kù),基于16S rDNA測(cè)序所得的OTU分類表對(duì)細(xì)菌群落的功能進(jìn)行注釋預(yù)測(cè)[17]。使用mothur軟件amova函數(shù)進(jìn)行組間群落結(jié)構(gòu)差異性分析。通過(guò) LEfSe軟件使用線性判別分析方法(linear discriminant analysis,LDA)進(jìn)行組間差異物種篩選。運(yùn)用Excel 2013和Origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 改性粘土對(duì)米氏凱倫藻的去除效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度(以下簡(jiǎn)稱濃度)為0.5 g/L的MCⅠ能夠迅速沉降水體中約70%的藻細(xì)胞,在之后的10 d內(nèi)藻細(xì)胞密度雖有一定程度的反彈,但最高密度遠(yuǎn)低于自然生長(zhǎng)的對(duì)照組的藻密度(約 8×107個(gè)/L) (圖1)。加入 0.5 g/L 的 MCⅡ后,對(duì)米氏凱倫藻去除率將近100%,且隨時(shí)間推移并未出現(xiàn)再次增殖的現(xiàn)象。由此可見(jiàn),同樣用量、不同類型改性粘土對(duì)同一種赤潮生物的去除率有較大差異,該結(jié)果與以往研究結(jié)果類似[18]。

圖1 不同處理組中米氏凱倫藻密度隨時(shí)間的變化情況Fig.1 Variation of K.mikimotoi density under contrasting systems

2.2 細(xì)菌密度、群落組成與功能預(yù)測(cè)

2.2.1 細(xì)菌密度

流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明,添加0.5 g/L的MCⅠ3 h后,絮體中細(xì)菌密度為(3.02±0.26)×1010個(gè)/L,此后持續(xù)增長(zhǎng)至第 26 d (7.52±0.30)×1011個(gè)/L; 經(jīng) 0.5 g/L的MCⅡ處理3 h后,絮體中細(xì)菌密度為(7.51±1.28)×1010個(gè)/L,而后增長(zhǎng)至第 26 d(5.18±0.30)×1011個(gè)/L(圖2)。

圖2 兩種類型絮體中細(xì)菌密度隨時(shí)間變化情況Fig.2 Variation of the bacterial density of flocs treated with two types of modified clay

2.2.2 細(xì)菌群落組成與多樣性

細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序后,平均每個(gè)樣品測(cè)得37 008條有效序列。所有樣品的序列經(jīng)過(guò)聚類后共得到1 422個(gè)OTU(operational taxonomic unit,操作分類單元),經(jīng)物種注釋后共獲得 21個(gè)門、36個(gè)綱、82個(gè)目、159個(gè)科和 322個(gè)屬的細(xì)菌。在屬水平上,兩實(shí)驗(yàn)組最大豐度排名前10的物種相對(duì)豐度如圖3所示。MCⅠ處理3 h后,絮體中細(xì)菌主要以Stenotrophomonas為主,且隨時(shí)間變化,Stenotrophomonas豐度逐漸降低,第26 d主要以Celeribacter和Altererythrobacter為主。添加MCⅡ后,絮體中優(yōu)勢(shì)菌屬同樣隨時(shí)間發(fā)生演替,由Altererythrobacter、Marivita、Fluviicola逐漸向Celeribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter轉(zhuǎn)變。選用Shannon指數(shù)評(píng)估不同改性粘土處理后絮體菌群的物種多樣性(圖4),MCⅠ組3 h的Shannon指數(shù)為0.44,而后逐漸升高至第26 d的4.93,MCⅡ組菌群多樣性指數(shù)由3 h的4.68降低至第11 d的2.43,此后第26 d回升至3.62。

圖3 屬水平最大豐度排名前10的細(xì)菌物種相對(duì)豐度圖Fig.3 Relative abundances of the top ten bacteria at the genus level

圖4 MCⅠ和MCⅡ組絮體中細(xì)菌的Shannon指數(shù)Fig.4 Bacterial Shannon index of MCⅠand MCⅡ flocs

2.2.3 細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

根據(jù) 16S rDNA序列的分類注釋結(jié)果,采用FAPROTAX工具對(duì)MCⅠ和MCⅡ組的細(xì)菌群落功能注釋后,分別獲得57和53種功能分組,最大豐度排名前20的功能分組信息如圖5所示。從圖中可以看出,化能異養(yǎng)(包括 chemoheterotrophy和 aerobic chemoheterotrophy)功能相對(duì)豐度較高,在所有樣本中均有出現(xiàn)。另外,在MCⅠ組中,具有硝酸鹽還原(nitrate reduction)、硝酸鹽呼吸(nitrate respiration)、固氮(nitrogen respiration)功能的細(xì)菌相對(duì)豐度較高; MCⅡ組中,除了化能異養(yǎng)功能外,細(xì)菌發(fā)酵功能(fermentation)的相對(duì)豐度較高,后期還出現(xiàn)了較高比例的硫氧化(dark sulfur oxidation)、硫化合物氧化(dark oxidation of sulfur compounds)和亞硫酸鹽氧化(dark sulfite oxidation)方面的細(xì)菌功能。

圖5 不同改性粘土處理后,絮體中細(xì)菌功能相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundances of bacterial function in flocs treated with different modified clays

2.3 主要水質(zhì)參數(shù)

本研究在分析不同處理組細(xì)菌密度和群落變化的同時(shí),也監(jiān)測(cè)了主要水質(zhì)參數(shù)的變化情況。經(jīng)改性粘土處理后,MCⅠ組3 h絮體中TOC濃度為(151.35±16.23) mg/L,實(shí)驗(yàn)前期略有下降,而后隨時(shí)間變化逐漸升高; MCⅡ組絮體TOC持續(xù)緩慢減少,由3 h的(203.18±2.69) mg/L 降至第 26 d(166.24±14.49) mg/L (圖6)。

圖6 不同改性粘土處理后,絮體TOC隨時(shí)間變化Fig.6 Changes of TOC in flocs after treatment with different modified clays over time

水體中硝酸鹽含量變化情況如圖7a所示,添加0.5 g/L的MCⅠ后,3 h水體中硝酸鹽含量為(467.00±11.35) μmol/L,而后隨時(shí)間變化持續(xù)降低至(262.15±5.86) μmol/L。加入 MCⅡ后,水體中硝酸鹽濃度為(460.30±6.59) μmol/L,一直降低至第 21 d 的(392.22±0.47) μmol/L,第 26 d 回升至(459.95±2.59) μmol/L。添加MCⅠ后,亞硝酸鹽濃度從(2.85±0.01) μmol/L增加到(35.09±4.12) μmol/L; 而 MCⅡ組亞硝酸鹽濃度變化幅度較小,在(1.41±1.94) μmol/L到(2.88±0.01) μmol/L范圍內(nèi)波動(dòng)(圖7b)。添加0.5 g/L的MCⅠ后,水體中銨鹽濃度為(3.92±0.00) μmol/L,此后逐漸增加至(14.70±0.83) μmol/L。添加MCⅡ后,銨鹽濃度一直上升,至第 26 d 為(22.28±3.02) μmol/L (圖7c)。

圖7 不同改性粘土處理后,水體中溶解無(wú)機(jī)氮各組分變化Fig.7 Changes in dissolved inorganic nitrogen in water treated with two types of modified clay

3 討論

3.1 改性粘土對(duì)細(xì)菌密度的影響

海洋細(xì)菌作為重要的分解者,以多樣化的代謝活動(dòng)參與海洋中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和分解過(guò)程,其密度是海洋微生物研究的關(guān)鍵參數(shù)。有不少研究表明,海洋細(xì)菌的密度[19-20]和群落結(jié)構(gòu)[21-22]與赤潮暴發(fā)關(guān)系密切,細(xì)菌與赤潮藻之間相互利用、相互選擇,形成特有的微生物群落結(jié)構(gòu)[23]。

改性粘土通過(guò)表面改性使原土表面由負(fù)電性轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦訹4],而細(xì)菌表面含有羧基和磷酸基團(tuán)等,帶有大量負(fù)電荷[24],與表面帶正電的改性粘土顆粒易發(fā)生絮凝沉降。有研究發(fā)現(xiàn),在魚蝦養(yǎng)殖中可以使用粘土絮凝沉降細(xì)菌,以防止養(yǎng)殖生物幼體受到病原菌感染[25]。本研究中,由于不同類型改性粘土絮凝效果不同,MCⅡ?qū)γ资蟿P倫藻的去除率高于MCⅠ(圖1),可以推斷 MCⅡ?qū)?xì)菌的絮凝效果也高于MCⅠ,致使3 h的MCⅡ組絮體中的細(xì)菌密度高于 MCⅠ組(圖2)。

細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要適宜的條件,如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、水分、環(huán)境含氧量等[26],本研究中 MCⅠ和 MCⅡ組溫度等環(huán)境條件穩(wěn)定,造成細(xì)菌密度變化的主要差異來(lái)源于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在后續(xù)的26天實(shí)驗(yàn)中,底層絮體中細(xì)菌密度持續(xù)增加,這是由于沉積絮體含有大量的藻源有機(jī)質(zhì),為異養(yǎng)細(xì)菌提供了豐富的碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[27]。Avnimelech[28]研究發(fā)現(xiàn),有機(jī)質(zhì)含量會(huì)影響細(xì)菌密度,隨著水體中 C/N的提高,異養(yǎng)細(xì)菌含量會(huì)顯著升高; Burford等[29]向養(yǎng)殖水體中添加有機(jī)碳,可以促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng),消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而可控制養(yǎng)殖水體的無(wú)機(jī)氮。本實(shí)驗(yàn)中,同樣用量、不同類型改性粘土對(duì)米氏凱倫藻的去除率不同(圖1),致使底層絮體中有機(jī)質(zhì)含量不同(圖6),TOC含量的差異可能會(huì)影響后續(xù)細(xì)菌密度的變化。實(shí)驗(yàn)前期(1～11 d),MCⅠ組絮體中細(xì)菌平均增長(zhǎng)速率為 2.14×1010個(gè)/(L·d),而 MCⅡ組細(xì)菌平均增長(zhǎng)速率為 3.44×1010個(gè)/(L·d)。由此可見(jiàn),MCⅡ組底層絮體中較高的有機(jī)質(zhì)含量為 MCⅡ組中細(xì)菌的增殖提供了更好的環(huán)境條件,可能是導(dǎo)致 MCⅡ組細(xì)菌的生長(zhǎng)率高于MCⅠ組的原因之一。在實(shí)驗(yàn)后期(11～26 d),MCⅠ組絮體中細(xì)菌平均增長(zhǎng)速率為3.38×1010個(gè)/(L·d),而MCⅡ組為 6.60×109個(gè)/(L·d),推測(cè)其原因可能是 MCⅠ組中再次生長(zhǎng)的藻細(xì)胞進(jìn)入衰亡期(圖1),水體中藻細(xì)胞死亡后沉降至底層,補(bǔ)充了絮體中藻源有機(jī)質(zhì)的含量,從而促進(jìn)了MCⅠ組底層絮體中細(xì)菌的生長(zhǎng);而在 MCⅡ組后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程里,絮體中無(wú)藻源有機(jī)質(zhì)補(bǔ)充,有機(jī)質(zhì)成為細(xì)菌生長(zhǎng)的限制條件,使得細(xì)菌的增長(zhǎng)速率減緩。

細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖需要消耗有機(jī)物,而 MCⅠ處理后米氏凱倫藻經(jīng)歷再次生長(zhǎng)與死亡的過(guò)程,在實(shí)驗(yàn)后期大量有機(jī)物沉降至底層,使得絮體中 TOC增長(zhǎng),所以,本研究對(duì) MCⅠ組前期和 MCⅡ組的細(xì)菌增長(zhǎng)速率與TOC消耗速率進(jìn)行相關(guān)性分析(圖8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)菌增長(zhǎng)速率與 TOC消耗速率呈正相關(guān)(P＜0.001),即 TOC消耗得越快,細(xì)菌增長(zhǎng)越快。由此可見(jiàn),MCⅠ與MCⅡ組中細(xì)菌密度變化與TOC含量密切相關(guān),絮體中TOC含量會(huì)影響細(xì)菌密度。

圖8 細(xì)菌增長(zhǎng)速率與TOC消耗速率之間的相關(guān)性Fig.8 Correlation analysis between bacterial growth rate and TOC consumption rate

3.2 改性粘土對(duì)細(xì)菌群落組成及功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同類型改性粘土不僅能影響細(xì)菌密度,同時(shí)也會(huì)對(duì)細(xì)菌群落組成產(chǎn)生一定影響(圖3)。MCⅠ和MCⅡ組組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P＜0.001),通過(guò) LEfSe分析(LDA score＞4)尋找 MCⅠ、MCⅡ組間差異顯著的物種,結(jié)果顯示,MCⅠ組的差異顯著的菌屬為Stenotrophomonas,MCⅡ組的差異物種有Celeribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter、Maribacter、Marivita、Alteromonas、Fluviicola(圖9)。

圖9 MCI和MCⅡ組絮體中細(xì)菌的LEfSe進(jìn)化分支圖Fig.9 LEfSe analyses of MC I and MC II

MCⅠ組的細(xì)菌群落以Stenotrophomonas為主。該細(xì)菌為一種革蘭氏陰性菌,約0.5～1.5 μm,有若干極生鞭毛,形態(tài)為微彎曲或直的桿狀[30-31],在水和土壤等自然環(huán)境中廣泛分布[31],有的還存在于植物根系中,能夠參與固氮[32],有的能夠降解一些復(fù)雜有機(jī)物[31],該屬下的細(xì)菌大多耐藥且抗菌,可用來(lái)作為生物防治劑[33]。近年來(lái),也曾多次在海洋環(huán)境中分離到該屬的細(xì)菌[34-35],陰盼晴[36]發(fā)現(xiàn)S.maitophilia可通過(guò)分泌胞外耐高溫活性物質(zhì)及胞外酶類抑制藻細(xì)胞存活,抑制赤潮藻錐狀斯式藻(Scrippsiella trochoidea)的生長(zhǎng)。Stenotrophomonas還是一種耐鹵菌群,能夠在高濃度的 NaCl條件下存活[37]。另外,Stenotrophomonas能夠產(chǎn)生螯合鋁的有機(jī)酸和增加溶液pH值的多糖來(lái)降低鋁的毒性,因此該菌能夠耐受高濃度鋁[38-39]。在MCⅠ組中,絮體中細(xì)菌物種多樣性指數(shù)前期較低(圖4),一種Stenotrophomonas占主要優(yōu)勢(shì),可能正是因?yàn)樵擃惣?xì)菌對(duì)MCⅠ中的聚合氯化鋁具有一定耐受性,或者M(jìn)CⅠ中的某些微量元素等綜合因素的影響刺激了Stenotrophomonas的生長(zhǎng),亦或未死亡米氏凱倫藻的影響。在MCⅠ組后期,絮體中菌群多樣性指數(shù)升高,Stenotrophomonas優(yōu)勢(shì)地位減弱,可能是由于米氏凱倫藻完全衰亡、或者M(jìn)CⅠ中的某些微量元素耗盡等原因,該結(jié)果將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

在 MCⅡ組中,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加逐漸變化,優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生演替,由Altererythrobacter、Marivita、Fluviicola逐漸變?yōu)镃eleribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter,推測(cè)該變化或與MCⅡ的改性劑——硫酸鋁有關(guān)。Fluviicola、Altererythrobacter、Marivita三種菌屬均為革蘭氏陰性菌,且為海水中常見(jiàn)的菌屬[40-42]。而隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的進(jìn)行,為適應(yīng) MCⅡ處理后的環(huán)境,細(xì)菌群落逐漸向Celeri-bacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter等菌屬轉(zhuǎn)變。Celeribacter最早從海洋分離[43],是一種化能異養(yǎng)菌,能夠氧化硫代硫酸鹽[44],Sulfitobacter能夠產(chǎn)生亞硫酸鹽氧化酶,該屬細(xì)菌可參與亞硫酸鹽的氧化[45-46],而Altererythrobacter屬下細(xì)菌可通過(guò)歧化反應(yīng)降解硫代硫酸鹽[47]。硫是構(gòu)成生命物質(zhì)所必須的元素,它是一些必需氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和輔酶的組成成分,它的轉(zhuǎn)化過(guò)程較為復(fù)雜,由多種硫細(xì)菌完成[48]。在MCⅡ組中,實(shí)驗(yàn)后期的菌屬大多能參與和硫相關(guān)的反應(yīng),推測(cè) MCⅡ組沉積絮體中存在硫轉(zhuǎn)化的可能。

不同類型的改性粘土對(duì)細(xì)菌群落組成產(chǎn)生了不同的影響,同時(shí)也會(huì)在一定程度上影響細(xì)菌群落的功能。而細(xì)菌在有機(jī)物礦化分解中起著重要作用,其功能在一定程度上影響了海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)。經(jīng)FAPROTAX對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5),在MCⅠ組中,具有硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸、固氮功能的細(xì)菌相對(duì)豐度較高,且上述功能在 MCⅠ和 MCⅡ組中存在顯著性差異(P＜0.05)。通過(guò)水質(zhì)參數(shù)變化發(fā)現(xiàn),MCⅠ組水體中硝酸鹽濃度降低、亞硝酸鹽濃度升高(圖7a,圖7b),推測(cè)其發(fā)生硝酸鹽還原過(guò)程。

相比 MCⅠ組,MCⅡ組中發(fā)酵作用的細(xì)菌功能相對(duì)豐度較高,后期還出現(xiàn)較高比例的硫、硫化合物和亞硫酸鹽氧化作用方面的細(xì)菌功能,上述功能在MCⅠ和 MCⅡ兩組間差異顯著(P＜0.05)。這可能與MCⅡ型改性粘土中改性劑有關(guān),而本實(shí)驗(yàn)中并未進(jìn)行與硫有關(guān)的水質(zhì)參數(shù)的測(cè)定,擬在今后的研究中進(jìn)一步完善和深入。

另外,MCⅠ和 MCⅡ組中化能異養(yǎng)功能均占有較高比例,結(jié)合水質(zhì)參數(shù)發(fā)現(xiàn),MCⅠ、MCⅡ組中TOC在實(shí)驗(yàn)前期均有所下降(圖6),由此可見(jiàn),MCⅠ和 MCⅡ組絮體中不同的細(xì)菌群落對(duì)藻源有機(jī)質(zhì)進(jìn)行了分解。此外,本研究中,MCⅠ組、MCⅡ組水體中銨鹽濃度均上升(圖7c),推測(cè)有機(jī)氮在異養(yǎng)菌的作用下發(fā)生了降解。海水中還原態(tài)氨氮主要是海洋生物代謝和死亡分解的終產(chǎn)物[49],有機(jī)氮可以直接脫氨基,氨基再與氫離子結(jié)合形成銨離子。

4 結(jié)論

1) 改性粘土處理后的26 d內(nèi),MCⅠ組和MCⅡ組絮體中細(xì)菌密度持續(xù)增長(zhǎng),且兩組間細(xì)菌的增長(zhǎng)速率不同,這是由于不同類型改性粘土對(duì)米氏凱倫藻的去除率不同,使底層絮體中的有機(jī)質(zhì)含量不同,從而影響細(xì)菌的密度變化。

2) 不同類型改性粘土對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同的影響,MCⅠ組絮體中細(xì)菌主要以Stenotrophomonas為主,MCⅡ組的優(yōu)勢(shì)種為Celeribacter、Muricauda、Altererythrobacter、Sulfitobacter等。通過(guò) FAPROTAX功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),MCⅠ組中的細(xì)菌具有較高豐度的硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸以及固氮等功能,MCⅡ組中硫氧化、硫化合物氧化、亞硫酸鹽氧化等與硫轉(zhuǎn)化有關(guān)的細(xì)菌功能占比較高。

致謝:感謝吳婷對(duì)實(shí)驗(yàn)部分的幫助,感謝張悅對(duì)文章修改的建議,同時(shí)十分感謝各位審稿專家對(duì)本文提出的建設(shè)性的修改意見(jiàn)與建議。