李楠，洪林巍，叢敬，高嵋，張桐桐

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)是我國(guó)高發(fā)疾病。目前，隨著全球人口老齡化進(jìn)程加快，CHD已經(jīng)成為全球死亡率升高的主要原因[1]。CHD是冠狀動(dòng)脈缺氧、狹窄而引起的血管狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧導(dǎo)致心臟疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完善，是多因素共同導(dǎo)致的結(jié)果?，F(xiàn)在關(guān)于CHD發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)頗多，已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激與CHD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞活化而釋放大量炎性因子參與血管損傷，影響心室重構(gòu)，加劇心肌細(xì)胞凋亡[2]。病理學(xué)研究證實(shí)，CHD患者中氧化應(yīng)激指標(biāo),如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)降 低，丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）顯著升高，能夠加快冠狀動(dòng)脈斑塊聚集，促進(jìn)斑塊形成而損傷心肌細(xì)胞[3]。

磷脂酞肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)通路在調(diào)控心肌細(xì)胞活性及心肌功能上具有重要作用。相關(guān)研究證實(shí)，在CHD大鼠中經(jīng)SO2預(yù)處理后PI3K/AKT表達(dá)激活，說(shuō)明提高其表達(dá)對(duì)心肌具有保護(hù)作用[4]。PI3K/AKT通過(guò)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移而導(dǎo)致粥樣斑塊產(chǎn)生，促進(jìn)CHD疾病形成。PI3K/AKT信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)因子，能夠介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞活性，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。中醫(yī)將CHD歸屬于“胸痹”、“心痛”范疇，結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論，眾多學(xué)者均認(rèn)為益心通脈顆粒能夠改善胸痹，緩解氣虛及血癖的功能。益心通脈顆粒是由玄參等藥物組成，能夠改善CHD大鼠血脂代謝，緩解病癥，但其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路及氧化應(yīng)激的影響尚不明確[5]，本研究通過(guò)建立CHD大鼠模型觀察益心通基于PI3K/AKT通路對(duì)其心肌損傷及應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3～4月SPF級(jí)Wistar健康大鼠60只，均經(jīng)BL-4205系統(tǒng)檢測(cè)無(wú)心電異常（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），動(dòng)物許可證：SCXK(湘)2018-0012，體質(zhì)量200～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、主要試劑與儀器益心通脈顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供）；格列吡嗪片，規(guī)格：5 mg（浙江海力生制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H19983114）；四氧嘧啶（南京森貝咖生物科技有限公司）；垂體后葉素（南京新貝藥業(yè)有限公司）；4%多聚甲醛（武漢卡諾斯科技有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（廣州威佳科技有限公司）；免疫組化試劑盒（武漢卡諾科技有限公司）。

1.3 分組及CHD動(dòng)物建模將60只大鼠按照數(shù)據(jù)隨機(jī)法分為A組（正常組）、B組（CHD組）、C組（格列吡嗪藥物對(duì)照組）、D組（低劑量益心通脈顆粒組）、E組（中劑量益心通脈顆粒組）及F組（高劑量益心通脈顆粒組），每組10只，除A組外其余組均給與高糖飼料（在正常飼料中加入蛋黃粉10%、膽固醇2%、豬油10%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.5%），建立CHD模型，在24～27℃飽和濕度下連續(xù)喂養(yǎng)8周后，腹腔注射30 U/(kg·d)垂體后葉素，連續(xù)3 d。A組大鼠普通飼料喂養(yǎng)8周后,腹腔注射5 ml/d生理鹽水，連續(xù)3 d。

1.4 干預(yù)方法建模成功后，C組大鼠給予0.5 mg/kg格列吡嗪溶于2 mL蒸餾水灌胃；D組、E組及F組大鼠均給予1.25 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的益心通脈顆粒溶于2 ml蒸餾水灌胃，其余組別大鼠均灌胃2 ml生理鹽水溶液，均干預(yù)4周。

1.5 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較采用1%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，分離腹腔，暴露后腹膜收取4 mL的主動(dòng)脈血，轉(zhuǎn)移離膠試管中，3 500 r/min離心（離心半徑10 cm），上清液放置-4℃保存。采用分光光度計(jì)檢測(cè)MDA、SOD、NO及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）。

1.6 組織提取及HE染色同上方法麻醉大鼠，提取心臟，甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋，后進(jìn)行5 μm切片，脫蠟后采用95%的酒精脫水，切片先放入蘇木精染色10 min后小流量自來(lái)水沖洗，1%的鹽酸乙醇褪色變紅后停止操作，采用碳酸鋰浸泡2 min后1%伊紅復(fù)染，逐級(jí)透水。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。

1.7 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心機(jī)細(xì)胞凋亡率心肌組織甲醛中固定4 h，脫水，經(jīng)辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）催化底物后生成深棕色沉淀物，采用蘇木精細(xì)胞核染色后，顯微鏡下觀察每張切片隨機(jī)選取不交叉重復(fù)的5個(gè)視野的深棕色沉淀物，顏色越深表示凋亡越多。凋亡率：凋亡/總細(xì)胞×100%。

1.8 免疫組化檢測(cè)心肌組織中PI3K、AKT表達(dá)心肌組織切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，逐級(jí)酒精浸水，枸櫞酸鹽水修復(fù)，自來(lái)水沖洗，加入PI3K、AKT抗體，4℃過(guò)夜后，放入山羊抗兔二抗孵育30 min，DAB染色，蘇木精復(fù)燃后逐級(jí)脫水，光鏡下觀察分析MIVnt圖形采集檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞吸光度，取平均值。

1.9 免疫印跡檢測(cè)心肌組織中PI3K、AKT蛋白心肌組織采用1%裂解液，BCA檢測(cè)蛋白，加入樣品后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1.5 h，PI3K（1：1 000）、AKT（1：1 000）一抗，內(nèi)參為GAPDH（1:2 000）,加入HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗（1：2 000），搖勻，采用TBST沖洗膜，最后ECI化學(xué)發(fā)光顯色，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS23.00軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD、NO及GSH-Px含量比較存在差異（P＜0.05）。和A組相比，B組大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA上調(diào)，SOD、NO及GSH-Px下調(diào)（P＜0.05），和B組相比，C組、D組、E組及F組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA下調(diào)，SOD、NO及GSH-Px上調(diào)（P＜0.05），與C組相比，D組大鼠血清中MDA含量上調(diào)，SOD、NO及GSH-Px含量下調(diào)（P＜0.05），與D組相比，F(xiàn)組大鼠血清中MDA含量下調(diào)，SOD、NO及GSH-Px含量上調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)組與C組MDA、SOD、NO及GSH-Px含量比較無(wú)明顯意義（P＞0.05），表1。

表1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.2 HE染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)

A組大鼠心肌組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰完整，橫紋整齊及規(guī)則分布，未見(jiàn)壞死溶解及炎癥表達(dá)。B組大鼠心肌組織纖維組織排列紊亂且間隙增大，出現(xiàn)溶解壞死及炎癥浸潤(rùn)顯著。C組、D組、E組及F組部分心肌組織可見(jiàn)肥大組織及溶解壞死，但與B組相比，通過(guò)藥物干預(yù)后上述病理癥狀有所緩解，且C組及F組改善最顯著，圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)(×200)

2.3 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率

各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率存在差異（F=15.230，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較，B組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率最高，和A組相比差異顯著（P＜0.05），與B組大鼠心肌組織凋亡率相比，C組，D組，E組及F組心肌細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05），與C組相比，D組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），與D組相比，F(xiàn)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），F(xiàn)組與C組相比無(wú)明顯意義（P＞0.05），圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織心肌細(xì)胞凋亡圖（×200）

圖3 各組大鼠心肌組織心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠心肌組織PI3K、AKT陽(yáng)性表達(dá)B組大鼠PI3K、AKT在心肌組織中細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量低于A組（P＜0.05），與B組相比，C組、D組、E組及F組大鼠心肌組織中PI3K、AKT細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量均升高（P＜0.05），與C組相比，D組大鼠心肌組織中PI3K、AKT細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量均降低（P＜0.05），與D組相比，F(xiàn)組大鼠心肌組織中PI3K、AKT細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量均升高（P＜0.05），F(xiàn)組與C組相比大鼠心肌組織中PI3K、AKT細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量無(wú)明顯意義（P＞0.05），表2、圖4。

表2 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)比較（個(gè)）

圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT陽(yáng)性表達(dá)圖（×200）

2.5 免疫印記檢測(cè)各組大鼠心肌組織PI3K、AKT蛋白水平與A組相比，B組大鼠PI3K、AKT蛋白水平在心肌組織中含量下調(diào)（P＜0.05），C組、D組、E組及F組大鼠上述指標(biāo)均高于B組（P＜0.05），與C組相比，D組大鼠心肌組織PI3K、AKT蛋白降低（P＜0.05），與D組相比F組心肌組織PI3K、AKT蛋白升高（P＜0.05），F(xiàn)組與C組PI3K、AKT蛋白水平相似（P＞0.05），表3、圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT蛋白電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT蛋白水平

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食習(xí)慣改變及生活壓力等多種原因促進(jìn)CHD發(fā)展，影響患者生活質(zhì)量及生命健康。中醫(yī)對(duì)CHD治療歷史悠久，認(rèn)為能夠通過(guò)增加血管活性藥物改善疾病的目的[6]。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激能增加血管內(nèi)皮損傷而促進(jìn)疾病發(fā)展。CHD患者氧化應(yīng)激伴腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活能夠提高血管緊張素水平，促進(jìn)氧化酶表達(dá)，增加氧化損傷[7]。體內(nèi)自由基SOD/MDA表達(dá)改善能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能損傷。SOD屬于一種細(xì)胞自由基清除劑，具有促進(jìn)超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的作用，同時(shí)可抑制MDA等氧化因子的表達(dá)，具有細(xì)胞修復(fù)和穩(wěn)定的作用。CHD存在大量活性氧及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物，參與機(jī)體氧化系統(tǒng)失衡，能夠較好反應(yīng)機(jī)體過(guò)氧化損傷程度[8]。毛?；踇9]研究表明，CHD存在明顯的血管炎癥損傷的同時(shí)伴隨NO及GSH-Px降低，證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了CHD疾病早期形成及發(fā)展。

格列吡嗪屬于磺脲類降糖藥物，能夠通過(guò)與胰島β細(xì)胞上的KATP通道相互結(jié)合而上調(diào)鈣離子通道，血液中較多的鈣離子對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制在于能夠增加KATP通道的開(kāi)放而發(fā)揮作用。體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表示，對(duì)缺血性心臟病大鼠采用格列吡嗪進(jìn)行灌胃能夠顯著減少大鼠缺血再灌注損傷，說(shuō)明其對(duì)心臟具有保護(hù)作用[10]。中醫(yī)認(rèn)為CHD的發(fā)病機(jī)理與氣血、血瘀及痰阻相關(guān)。漢代張仲景認(rèn)為胸痹是胸中陽(yáng)氣不足、經(jīng)絡(luò)不通所導(dǎo)致。經(jīng)過(guò)歷代學(xué)者研究認(rèn)為CHD的治病機(jī)制在于生血、通氣、破淤及化痰[11]。益心通脈顆粒能夠通過(guò)改善冠狀動(dòng)脈狹窄而降低術(shù)后CHD患者M(jìn)ACE發(fā)生。益心通脈顆粒是由黃芪、丹參、葛根、人參、當(dāng)歸等組成，黃芪味甘性溫，歸肝脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣、生血、升陽(yáng)氣等功效，在本方中助生血之功效[11]。張子龍等[12]研究表示，丹參味苦性寒，歸心、肝經(jīng)，能夠破血、有化瘀及安神等功效。人參味甘，微苦，歸肺、心經(jīng)，是大補(bǔ)之藥，能與黃芪合用治療氣虛之癥?，F(xiàn)代藥理標(biāo)明，中藥人參中包含多種天然抗氧化劑，其中人參皂苷能夠通過(guò)提高CHD血清中SOD表達(dá)水平，增加脂質(zhì)抗氧化能力進(jìn)而抑制MDA表達(dá)。丹參是改善心血管疾病的天然藥物，在CHD氧化應(yīng)激損傷中減少白細(xì)胞過(guò)度激活而降低血小板黏附抑制血管內(nèi)壁斑塊產(chǎn)生，具有保護(hù)心肌作用。榮鴿璇[13]研究表示，抗氧化應(yīng)激可能是融斑通脈顆粒防治冠狀動(dòng)脈斑塊產(chǎn)生的機(jī)制之一，與常規(guī)西藥相比具有安全性高等特點(diǎn)。本文研究證實(shí)，益心通脈顆粒能夠通過(guò)減少CHD大鼠血清中氧化應(yīng)激水平而降低心肌損傷。

眾多文獻(xiàn)證實(shí)，CHD氧化應(yīng)激能夠改變心肌組織結(jié)構(gòu)，加劇心肌細(xì)胞凋亡。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞后加入低濃度的H2O2能夠促進(jìn)凋亡，并隨著濃度的升高而出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，表示ROS能夠作為心肌細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)因子，當(dāng)被激活時(shí)能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。本研究指出CHD大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)升高，心肌組織中含有負(fù)氧離子及ROS表達(dá)升高，能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)生解體，這與以往學(xué)者研究相似。益心通脈顆粒中的人參主要活性成分為人參總皂苷，可發(fā)揮心肌細(xì)胞凋亡增加抗氧化能力、減少心肌組織缺血面積、抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與平衡bac-1/bax平衡相關(guān)。員小利等[15]研究表示，丹參發(fā)揮保護(hù)心肌組織的作用在于降低鈣離子超載，增加SOD表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)改善心肌細(xì)胞凋亡。黃芪是抗CHD常用藥物，主要通過(guò)穩(wěn)定心肌組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及提高心肌收縮能力而改善心肌損傷。陳家顯[16]研究表示，芪參益氣滴丸通過(guò)抑制慢性心衰大鼠心肌組織缺氧缺血而改善心肌組織病理改變，抑制心肌細(xì)胞凋亡。本文HE染色發(fā)現(xiàn)，CHD大鼠心肌組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，利用TUNEL檢測(cè)法觀察心肌組織出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡，通過(guò)采用益心通脈顆粒灌胃后CHD大鼠心肌組織形態(tài)發(fā)生改變，心肌細(xì)胞凋亡率降低，表示益心通脈顆粒能夠通過(guò)調(diào)節(jié)某種信號(hào)通路而減少心肌損傷。本文研究與上述相似。

以往研究證實(shí)，在缺氧心血管疾病中PI3K/AKT具有釋放NO水平而舒張血管作用。AKT表達(dá)上具有激活增加靜息時(shí)血管直徑及血流的作用，可作為血管張力的調(diào)節(jié)因子[17]。PI3K可與AKT形成PH結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)作用[18]。在CHD中PI3K/AKT表達(dá)降低，無(wú)法發(fā)揮信號(hào)調(diào)節(jié)作用，當(dāng)PI3K/AKT激活后能夠抑制CHD大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低核轉(zhuǎn)錄因子κB活性，提高SOD表達(dá)水平[19]。徐源[20]研究表示，黃芪甲苷能夠通過(guò)提高PI3K/ATK表達(dá)而減少心臟缺血再灌注損傷，起到保護(hù)心肌的作用。丹酚酸來(lái)源于丹參根部，具有抗氧化機(jī)制，可降低炎性因子水平，其作用機(jī)制主要是通過(guò)上調(diào)AKT表達(dá)、提高細(xì)胞凋亡基因（Bacl-2）活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。王亞利[21]表示和血生絡(luò)方中包含人參、當(dāng)歸、丹參及紅景天等，其藥用機(jī)理在于通過(guò)上調(diào)缺血心肌組織中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及PI3K/ATK表達(dá)而促進(jìn)血管新生。本研究證實(shí)，益心通脈顆粒能夠通過(guò)上調(diào)心肌組織中PI3K/AKT表達(dá)而保護(hù)心肌、抗氧化應(yīng)激損傷，從而減少心肌細(xì)胞凋亡等作用。

本研究基于中醫(yī)理論論證益心通脈顆粒對(duì)CHD的作用機(jī)制，但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在一定不足，由于時(shí)間及經(jīng)費(fèi)受限，未加入更多組別，如PI3K/ATK抑制劑等，也未進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)探究對(duì)CHD的作用機(jī)制，今后應(yīng)加入更多試驗(yàn)，豐富CHD的基礎(chǔ)研究，為臨床研究提供基礎(chǔ)。綜上所述，益心通脈顆粒能夠通過(guò)減少CHD大鼠氧化應(yīng)激降低心肌組織病理?yè)p傷而心肌細(xì)胞凋亡，這與上調(diào)PI3K/AKT通路表達(dá)相關(guān)。