雷乃軍， 祝德， 龍家才， 張旭明， 宋爭放

腎透明細胞癌是腎細胞癌中最常見的組織學(xué)類型，約占腎細胞癌的75%[1]。目前根治性手術(shù)是腎透明細胞癌的主要治療手段，療效確切，但仍有20%～40%的患者術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠處臟器的轉(zhuǎn)移，因此研究腎透明細胞癌的發(fā)病及進展機制將有利于其臨床診斷和治療[2]。腎臟為酮體代謝的主要靶器官，具有很強的酮體代謝能力[3]。酮體是體內(nèi)脂肪酸分解代謝的重要產(chǎn)物，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[4]。3-羥基丁酸脫氫酶2(3-hydroxybutyrate dehydrogenase 2，BDH2)和膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1(acy1 coenzyme A:cholesterol acyltransferases1，ACAT1)作為酮體代謝過程中的關(guān)鍵基因，在鼻咽癌、肝癌及結(jié)直腸癌等癌癥的相關(guān)研究中已有報道[5-8]，但是其在腎透明細胞癌中的研究報道極少。本研究通過分析腎透明細胞癌組織中ACAT1、BDH2基因的表達情況，探討ACAT1、BDH2基因與腎透明細胞癌患者發(fā)病及病情進展的關(guān)系，以期為臨床診治腎透明細胞癌提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年5月至2020年5月巴中市人民醫(yī)院收治的86例腎透明細胞癌患者，其中男55例，女31例；年齡22～78(60.2±5.0)歲；有吸煙史38例(指連續(xù)或累積吸煙時間6個月及以上)；有飲酒史60例(指每周飲酒不少于1次，連續(xù)6個月以上)；腫瘤部位：左腎40例，右腎46例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳ期10例。納入標準：①術(shù)后病理診斷為腎透明細胞癌；②入院前未接受任何抗癌治療，如放療、化療等；③無自身免疫性疾病。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴重感染性疾??；③合并血液系統(tǒng)疾病；④嚴重的心、肝、肺、腦功能不全；⑤依從性差，不能配合完成本研究。另選擇我院同期收治的因腎外傷行腎切除的患者30例為對照組，其中男20例，女10例；年齡20～75(59.6±5.5)歲；有吸煙史13例；有飲酒史21例。兩組患者的性別(χ2=0.071)、年齡(t=0.551)、吸煙史(χ2=0.006)、飲酒史(χ2=0.001)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有納入對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 收集研究組術(shù)中切除的腎透明細胞癌組織及對照組術(shù)中切除的腎組織，應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測兩組組織中的ACAT1、BDH2基因相對表達量，操作如下：用總RNA提取試劑盒(上海儒安生物科技有限公司，貨號YT9197)提取組織中的總RNA，檢測其完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京雅安達生物技術(shù)有限公司，貨號YT9036)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。PCR擴增體系為：cDNA模板5 μl，dNTP 1 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl(引物序列見表1)，10×Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5 μl，去離子水15 μl，反應(yīng)體系共25 μl。擴增結(jié)束后分析熔解曲線并讀取循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用2-△△Ct法進行計算，結(jié)果取均值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組ACAT1、BDH2基因表達量比較 研究組的ACAT1基因相對表達量為11.52±0.99，低于對照組(13.93±1.32)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.143，P<0.05)；研究組的BDH2基因相對表達量為10.48±0.73，也低于對照組(12.86±1.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-11.870，P<0.05)。

2.2 不同臨床病理特征腎透明細胞癌患者癌組織中ACAT1、BDH2基因相對表達量比較 不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理分級的腎透明細胞癌患者癌組織中ACAT1、BDH2基因相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的腎透明細胞癌患者癌組織中ACAT1、BDH2基因相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細胞癌患者的ACAT1、BDH2基因相對表達量較低，見表2。

表2 不同臨床病理特征腎透明細胞癌患者癌組織中ACAT1、BDH2基因相對表達量比較

2.3 ACAT1、BDH2基因與腎透明細胞癌患者病情進展的相關(guān)性分析 ACAT1基因相對表達量與腎透明細胞癌患者的病理分期(r=-0.436)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=-0.412)呈負相關(guān)(P<0.05);BDH2基因相對表達與腎透明細胞癌的病理分期(r=-0.558)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=-0.450)亦呈負相關(guān)(P<0.05)。

2.4 ACAT1、BDH2基因與腎透明細胞癌患者發(fā)病的關(guān)系 以腎透明細胞癌為因變量(有=1，無=0)，以年齡(<60歲=0，≥60歲=1)、性別(女=0，男=1)、吸煙史(有=1，無=0)、飲酒史(有=1，無=0)、ACAT1基因相對表達量(<11.0=1，≥11.0=0)、BDH2基因相對表達量(<12.0=1，≥12.0=0)為自變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示ACAT1、BDH2基因表達下調(diào)是腎透明細胞癌患者發(fā)病的危險因素(P<0.05，表3)。

表3 Logistic回歸分析ACAT1、BDH2基因與腎透明細胞癌患者發(fā)病的關(guān)系

3 討論

腎透明細胞癌的早期癥狀隱匿，患者在確診時多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，又因其生物學(xué)特性復(fù)雜，手術(shù)切除不易徹底，對放化療不敏感，因此研究腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制成為臨床亟待解決的問題。

近年來有研究顯示，酮體代謝異常與惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)[9]。BDH2和ACAT1為酮體代謝的關(guān)鍵基因，能夠調(diào)控酮體生成及利用。ACAT1是目前發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)唯一能夠催化游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)-CHO)及長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid，LCFA)合成膽固醇酯的酶，可參與脂肪酸、膽固醇的吸收，是脂質(zhì)代謝平衡過程中的關(guān)鍵酶之一。ACAT1基因位于人類1號和7號染色體，其基因組長度大于100 kb。ACAT1大量表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。ACAT1可以促進癌細胞糖酵解，使癌細胞增殖能力變強，如乳腺癌、結(jié)腸癌及前列腺癌等[11]。BDH2屬于短鏈脂肪酸脫氫酶家族，能夠氧化β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid，β-HBA)生成乙酰乙酸(acetoacetic acid，AcAc)。BDH2基因位于人類染色體4q24上，包含了7個外顯子，全長22 249 bp。文獻報道，Ⅰ期食管癌患者的BDH2水平低于Ⅱ～Ⅲ期食管癌患者，敲除BDH2基因后能夠促進食管癌細胞凋亡[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)BDH2在白血病細胞系中表達上調(diào)，下調(diào)BDH2表達能增加白血病細胞系的凋亡[13]。BDH2在腦膠質(zhì)瘤中呈低表達[14]?？赡苁怯捎贐DH2參與兩種不同的代謝：酮體代謝及細胞的鐵代謝，因此導(dǎo)致BDH2在不同腫瘤細胞中的表達水平有所不同。本研究結(jié)果顯示BDH2和ACAT1基因在腎透明細胞癌中表達下調(diào)，提示BDH2和ACAT1可能與腎透明細胞癌發(fā)病有關(guān)。Logistic回歸分析顯示ACAT1、BDH2基因表達下調(diào)是腎透明細胞癌患者發(fā)病的危險因素，提示ACAT1、BDH2基因表達水平越低，腎透明細胞癌發(fā)病風(fēng)險越大。Spearman相關(guān)分析顯示ACAT1、BDH2基因相對表達量與腎透明細胞癌患者病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關(guān)，提示BDH2和ACAT1可能與腎透明細胞癌病情進展有關(guān)。其具體機制可能是脂肪酸的代謝產(chǎn)物為癌細胞分裂增殖提供必需的能量、物質(zhì)及細胞信號分子，酮體是脂肪酸代謝的重要產(chǎn)物，已被證實能促進腫瘤發(fā)生；酮體代謝過程中的關(guān)鍵基因BDH2、ACAT1具有調(diào)控酮體生成的作用，ACAT1表達下調(diào)可使癌細胞中的β-羥丁酸含量減少，BDH2表達下調(diào)導(dǎo)致細胞中酮體生成減少，從而對腎透明細胞癌的發(fā)病及病情進展發(fā)揮促進作用。

綜上所述，ACAT1、BDH2基因在腎透明細胞癌中表達下調(diào)，ACAT1、BDH2基因與腎透明細胞癌發(fā)病及病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。