趙斯鈺，吳 言，鄭妍妍，高 蘭，賈珊珊

(陜西省西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710003)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是因病毒、真菌、細(xì)菌等各種致病微生物感染引起的腦實(shí)質(zhì)或脊髓炎癥性病變。因中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏淋巴管，蛛網(wǎng)膜下腔缺少毛細(xì)血管，感染后炎癥反應(yīng)癥狀往往病情嚴(yán)重，病情進(jìn)展迅速[1-2]。這就對(duì)疾病的早期診斷提出更高要求，以便針對(duì)性治療，避免延誤最佳治療時(shí)機(jī)。高通量測(cè)序，即二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)，利用現(xiàn)有微生物群基因信息群，采用生物信息學(xué)方法，與測(cè)序結(jié)果比對(duì)，進(jìn)而鑒別微生物種類(lèi)[3-4]。但目前有關(guān)NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的診斷價(jià)值，卻少有報(bào)道。本研究回顧性分析81例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒臨床資料，探討NGS的應(yīng)用價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 納入2019年2月—2020年8月我院收治的81例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷參照腦脊液病原體培養(yǎng)結(jié)果[5]；②患兒年齡0～14歲；③患兒病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①凝血功能障礙者；②拒絕腰椎穿刺者；③合并有顱腦外傷、顱內(nèi)出血或腦腫瘤者；④肝腎功能不全或有嚴(yán)重心肺基礎(chǔ)性疾病者。根據(jù)腦脊液病原體培養(yǎng)結(jié)果將81例患兒分為A組(病毒性腦炎，20例)、B組(結(jié)核性腦膜炎，28例)、C組(化膿性腦膜炎，24例)及D組(隱球菌性腦膜炎，9例)。四組患兒基本資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組患兒基本資料比較

1.2儀器和試劑 Select BioProducts型渦旋震蕩儀(廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司)。蛋白酶K(上海云序生物科技有限公司)，裂解液(按GB：Carrier RNA=100∶1比例配置，杭州開(kāi)泰生物技術(shù)有限公司)，洗脫緩沖液(赫澎生物科技有限公司)。

1.3腦脊液采集 在發(fā)病急性期(入院周內(nèi))行常規(guī)腰椎穿刺術(shù)：患者側(cè)臥、屈膝，脊柱后凸，以髂后上棘連線與脊柱后正中線交點(diǎn)為穿刺點(diǎn)(一般為第3～4腰椎棘突間隙)，采用2%利多卡因進(jìn)行局部麻醉，麻醉起效后進(jìn)針，進(jìn)針深度4～6 cm，在患者感到有阻力消失的落空感時(shí)，緩慢抽出，留取3 mL腦脊液，冷凍保存?zhèn)溆茫?4 h內(nèi)送檢。

1.4NGS 檢查時(shí)先解凍，將樣本置于離心管內(nèi)，采用Select Bio Products型渦旋震蕩儀進(jìn)行震蕩破壁，再次離心后取上清液。取600 μL樣本，加入10 μL蛋白酶K。加入300 μL裂解液，37 ℃溫浴1 h，加入無(wú)水乙醇。吸取樣本混合物，離心后棄濾液。依次向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD、600 μL漂洗液PW，離心后棄濾液。將吸附柱晾干，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入50 μL洗脫緩沖液TB，靜置后離心，取濾液，作為DNA溶液。采用SinapTec超聲波破碎儀將樣本DNA打斷至150～200 bp。采用Qubit dsDNA HS Assay Kit質(zhì)控DNA文庫(kù)濃度，采用BGISEQ-500/50 NGS系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。采用BWA去除人源性序列、低質(zhì)量序列及含N序列。與細(xì)菌庫(kù)、病毒庫(kù)及真菌庫(kù)比對(duì)，計(jì)算相關(guān)參數(shù)。

1.5診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]以Unique reads條數(shù)≥2為NGS結(jié)果陽(yáng)性，判定為病毒性腦膜炎；以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群種水平序列數(shù)(mycobacterium tuberculosis complex species level sequence number，MRN)≥1為結(jié)果陽(yáng)性，判定為結(jié)核性腦膜炎；以Unique reads條數(shù)≥5為NGS結(jié)果陽(yáng)性，判定為化膿性腦膜炎；以NGS發(fā)現(xiàn)隱球菌DNA為結(jié)果陽(yáng)性。以腦脊液病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，病毒性腦炎：腦脊液檢測(cè)特異性病毒抗體，腦脊液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；驍?shù)十倍增高，臨床可見(jiàn)顱內(nèi)壓升高、發(fā)熱或意識(shí)障礙、驚厥；隱球菌性腦膜炎：腦脊液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病原菌，臨床可見(jiàn)發(fā)熱、漸進(jìn)性頭痛、精神錯(cuò)亂、嗜睡；結(jié)核性腦膜炎：以腦脊液病原學(xué)檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，臨床可見(jiàn)間斷頭痛、發(fā)熱、驚厥、反射消失或肢體癱瘓；化膿性腦膜炎：以腦脊液病原學(xué)檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，臨床可見(jiàn)顱內(nèi)壓升高，腦膜刺激征。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料組間比較采用F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NGS判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病價(jià)值分析 NGS檢測(cè)隱球菌性腦膜炎NGS診斷化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎的 Kappa值高于病毒性腦炎好結(jié)核性腦炎。見(jiàn)表2。

表2 NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病結(jié)果 (例數(shù)，%)

2.2NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病價(jià)值比較 NGS診斷病毒性腦炎、結(jié)核性腦膜炎、化膿性腦膜炎及隱球菌性腦炎的特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中NGS診斷隱球菌性腦膜炎的特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值顯著高于其診斷病毒性腦炎和結(jié)核性腦炎的價(jià)值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的價(jià)值比較 (例數(shù)，%)

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病發(fā)病范圍廣泛，多發(fā)生于老年和兒童，尤其以兒童最為多見(jiàn)，且兒童機(jī)體功能尚未發(fā)育成熟，自身免疫抵抗能力低下，病情進(jìn)展迅速，部分患兒可造成后遺癥，甚至致殘致死，導(dǎo)致不良預(yù)后的發(fā)生[8]。近年來(lái)研究顯示，因顱腦有創(chuàng)檢查的開(kāi)展、免疫功能降低及抗生素的濫用等原因，兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病發(fā)生率有上升趨勢(shì)[9]。早期準(zhǔn)確診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是有效治療和改善預(yù)后的關(guān)鍵，因而本研究重點(diǎn)探討NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒診療中的應(yīng)用價(jià)值。

病毒性腦炎多因帶狀皰疹病毒和單純皰疹病毒感染引發(fā)，是臨床最常見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病類(lèi)型之一[10]。腦組織病毒分離檢測(cè)是目前病毒性腦炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但腦組織活檢創(chuàng)傷大、耗時(shí)長(zhǎng)[11]，難以在臨床廣泛推廣。而NGS則無(wú)需使用特異性病原體引物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原體的無(wú)靶向、無(wú)偏移篩查[12]。因RNA易降解，本研究采用DNA進(jìn)行測(cè)序，對(duì)于感染累及軟腦膜的患兒，因血腦屏障的存在，病原體先進(jìn)入腦脊液，然后隨腦脊液回收進(jìn)入血液循環(huán)[13]，因而以腦脊液為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測(cè)，敏感度更高。另外，對(duì)于病毒性腦炎疑似患兒，經(jīng)抗生素干預(yù)治療后，病毒核酸逐漸被降解，這可能是NGS陽(yáng)性檢出率較低的原因[14]，因而對(duì)于疑似患兒應(yīng)盡早進(jìn)行NGS檢查，以實(shí)現(xiàn)病毒性腦炎的早診斷和早處理，改善患兒預(yù)后?；撔阅X炎可經(jīng)血行感染、醫(yī)源性感染等多途徑感染導(dǎo)致，病情兇險(xiǎn)。腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)作為診斷化膿性腦炎的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然特異度高，但敏感度僅0.25[15]。而隱球菌性腦膜炎雖然發(fā)病率低，但隱球菌性腦膜炎影像檢查結(jié)果和臨床癥狀缺乏特異性，具有多變性。既往多依靠實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷，但此種方法陽(yáng)性率低，且結(jié)果依賴與操作者技術(shù)水平，臨床推廣受到局限。NGS根據(jù)酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)原理，獲得互補(bǔ)鏈序列信息，完成樣品分析，為臨床診斷提供依據(jù)[16-17]。本研究采用NGS進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)NGS判斷化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎的Kappa值較為滿意，準(zhǔn)確度分別為82.72%和90.12%。本研究以Unique reads≥5為陽(yáng)性判斷依據(jù)，結(jié)果顯示其判斷化膿性腦炎的敏感度和特異度均尚可。而NGS診斷隱球菌性腦膜炎的特異度和陰性預(yù)測(cè)值分別達(dá)90.28%和98.48%，高于對(duì)其他類(lèi)型疾病的識(shí)別率，提示NGS對(duì)診斷隱球菌性腦膜炎價(jià)值較高，這與Zhang等[18]結(jié)果一致。NGS可對(duì)病原體進(jìn)行分子診斷，與腦脊液病原菌培養(yǎng)相比，診斷時(shí)間也顯著縮短，這為早期診斷和治療創(chuàng)造條件，有助于改善患兒預(yù)后。目前有關(guān)NGS在結(jié)核性腦膜炎診療中的專(zhuān)項(xiàng)報(bào)道還較為少見(jiàn)，本研究顯示NGS診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均低于65.00%，提示NGS診斷結(jié)核性腦膜炎的價(jià)值有限，這可能是因在提取腦脊液上清液標(biāo)本過(guò)程中，大量胞內(nèi)寄生的結(jié)核分枝桿菌被遺漏有關(guān)[19]。這說(shuō)明NGS可能作為結(jié)核性腦膜炎的輔助檢查手段。

但NGS需要檢測(cè)醫(yī)師具備一定專(zhuān)業(yè)技能和知識(shí)。另外，人源性核酸和共存微生物核酸數(shù)量較大，可影響致病菌在提取核酸中的比例，進(jìn)而降低NGS的敏感度[20]。因而，減少外源性污染可能有助于提高NGS的應(yīng)用價(jià)值。有學(xué)者提出宏基因組NGS技術(shù)，以縮短檢測(cè)時(shí)間，提高病原體檢測(cè)敏感度，但該技術(shù)在人源性序列干擾、定植及致病菌鑒別方面缺乏標(biāo)準(zhǔn)化依據(jù)[21]，這可稱(chēng)為NGS未來(lái)發(fā)展方向。

綜上所述，NGS對(duì)診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病具有重要價(jià)值，尤其是對(duì)于化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎，診斷準(zhǔn)確度高。