劉 陽，康 林，鄭國娜，趙煥芬

(河北省人民醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050051)

卵巢癌(ovarian cancer)每年大約新增240 000例患者，世界上第七常見的女性癌癥，全球女性死亡最常見原因之一，探索卵巢癌發(fā)病機制、診斷標記物、潛在治療靶點、預(yù)后相關(guān)指標已成為熱門研究領(lǐng)域。盡管卵巢癌的診斷和治療有了顯著的改善，但許多患者的預(yù)后仍然很差，特別是晚期卵巢癌患者。為解決這一難題，研究者們試圖尋找生物標記物來輔助卵巢癌的臨床診斷和預(yù)后評價[1-3]。富含半胱氨酸腸蛋白1(cysteine-rich intestinal protein 1，CRIP1)是相對分子質(zhì)量為8 000的小分子蛋白[4]。近年來已有文獻報道其在多種類型腫瘤中過表達，包括甲狀腺癌[5]、結(jié)直腸癌[6-7]、宮頸癌[8]等，并對疾病的預(yù)后有重要的影響，然而在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用至今尚不清楚，也未曾有文獻報道，因此本研究通過采用生物信息學(xué)方法探究CRIP1在卵巢癌中表達水平、與患者預(yù)后關(guān)系以及相關(guān)生物學(xué)功能，建議CRIP1成為卵巢癌診治的重要靶點和預(yù)后判斷的關(guān)鍵指標。

1 資 料 與 方 法

1.1CRIP1基因在各類癌癥中的表達水平 使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www. oncomine.org/)分析CRIP1基因在不同類型癌癥研究中的表達水平以及在不同病理分型的卵巢癌中的表達分布。篩選條件：①Gene，CRIP1；②Analysis type，Cancer vs Normal analysis；③P-value，0.05；④Fold change，1.5；⑤Gene rank，All；⑥D(zhuǎn)ate type，Mrna。

1.2CRIP1表達與卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系 運用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析高表達CRIP1的卵巢癌患者和低表達CRIP1的卵巢癌患者總生存期、無進展生存期、進展后生存期的關(guān)系，篩選條件：①Spite patients by：auto select best cutoff；②Follow up threshold：all；③Probe set options：user selected probe set；④Survival：overall survival/progression-free survival/post pro-gression survival。根據(jù)臨床特征，包括不同腫瘤分期、腫瘤分級、不同化療藥方案對卵巢癌患者進行分組，分析CRIP1基因表達與卵巢癌患者總生存期的關(guān)系。

1.3分析卵巢癌中CRIP1相互作用功能蛋白 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)11.0版本在人類物種中檢索目的基因CRIP1，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)，并且基于關(guān)鍵蛋白節(jié)點進行Go-Biological Process分析。篩選條件：①protein name：CRIP1；②organism： Homo sapiens。

1.4分析卵巢癌中與CRIP1緊密相關(guān)蛋白 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)分析CRIP1與緊密相關(guān)蛋白的P值和Pearson相關(guān)系數(shù)。篩選條件：①Gene A,CRIP1；②Gene B,相關(guān)蛋白；③Correlation Coefficient,Pearson；④Used Expression Datasets,TCGA Tumor，Ovarian serous cystadenocarcinoma。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析CRIP1基因的表達水平，比較采用獨立樣本t檢驗;Kaplan-Meier Plotter分析CRIP1基因表達與卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系，采用Log-rank檢驗比較其高表達和低表達的卵巢癌患者生存差異; GEPIA數(shù)據(jù)庫分析Pearson相關(guān)系數(shù)，篩選與CRIP1具有正、負相關(guān)性的功能蛋白。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRIP1基因在多種類型腫瘤中差異性表達 在卵巢癌中高表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫收集到337項CRIP1基因與腫瘤相關(guān)研究，166項研究中腫瘤組織與正常組織的CRIP1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中有102項研究中CRIP1在腫瘤組織中表達呈現(xiàn)升高水平，包括乳腺癌(24項)、腎癌(8項)、淋巴瘤(12項)、白血病(8項)以及卵巢癌(6項)等。64項研究中CRIP1在腫瘤組織中表達呈現(xiàn)下降水平，包括結(jié)直腸癌(9項)、頭頸癌(8項)、腎癌(6項)、以及肺癌(15項)等，其中在卵巢癌的研究中CRIP1 mRNA在癌組織中均過表達分布，未發(fā)現(xiàn)有表達下調(diào)的研究(圖1)。在卵巢癌不同病理分型的6項研究中，CRIP1在各類卵巢癌中的表達水平均高于正常卵巢組織(差異倍數(shù)>1.5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同分型卵巢癌與正常卵巢組織間CRIP1表達 顯著性變化Table 1 The significant changes of CRIP1 expression between different types of ovarian cancer and normal ovary tissue

圖1 CRIP1基因在不同類型腫瘤中表達水平

2.2CRIP1高表達的卵巢癌患者預(yù)后較差 運用Kaplan-Meier Plotter分析CRIP1基因表達與卵巢癌患者預(yù)后的相關(guān)性，包括卵巢癌患者10年總生存期、無進展生存期以及進展后生存期3個指標。總生存期關(guān)系：CRIP1高表達組卵巢癌患者總生存期顯著低于低表達組卵巢癌患者(P<0.05；HR=1.14)；無進展生存期關(guān)系：CRIP1低表達組卵巢癌患者無進展生存期顯著高于高表達組患者(P<0.05；HR=1.19)；進展后生存期關(guān)系：CRIP1低表達組和高表達組卵巢癌患者進展后生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；HR=0.86)，以上數(shù)據(jù)預(yù)示CRIP1基因可作為卵巢癌預(yù)后診斷標記物(圖2)。接下來根據(jù)臨床特征分析CRIP1基因表達與卵巢癌患者總生存期的關(guān)系，把卵巢癌患者按照不同腫瘤分期和腫瘤分級進行分組，并未發(fā)現(xiàn)CRIP1高表達組和低表達組患者總生存期在不同階段存在顯著差異。然而按照卵巢癌患者接受不同的化療方案進行分組，發(fā)現(xiàn)使用紫杉醇、多西他賽、拓撲替康化療藥的患者中，CRIP1高表達組總生存期顯著低于低表達組(P<0.01，HR=1.88；P<0.05，HR=1.75；P<0.05，HR=1.57)，說明CRIP1高表達的卵巢癌患者接受上述3種化療方案后預(yù)后較差，見表2。

表2 根據(jù)臨床特征分析CRIP1高表達與 低表達組卵巢癌患者總生存期關(guān)系Table 2 The analysis of overall survival of ovarian cancer patients with high or low expression of CRIP1 according to the clinical characteristics

圖2 CRIP1基因高表達和低表達的卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系

2.3探索CRIP1相互作用的功能蛋白，并進行GO分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測到CRIP1蛋白與20個功能蛋白有相互作用，構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)LMO1、LMO2、LMO3、PQLC3、CBFB、DBI、LGALS3、YAP1、STK3、STK4、CEBPE、CAPG、LIMS2、NME1、TAGLN2、ATOX1、KBTBD11、FGD2、ANKLE1、DSTN與CRIP1蛋白相互作用。進一步使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析，獲得4個功能蛋白在卵巢漿液性囊腺癌中與CRIP1蛋白關(guān)系更為密切，其中與STK4(r=-0.24，P<0.001)和YAP1(r=-0.24，P<0.001)呈負相關(guān)，與LGALS3(r=0.23，P<0.001)和ATOX1(r=0.22，P<0.001)呈正相關(guān)(圖3)；基于相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，進行CRIP1蛋白生物過程Go分析，發(fā)現(xiàn)CRIP1蛋白參與造血干細胞分化的調(diào)控、調(diào)節(jié)造血功能、Hippo信號通路、發(fā)育過程調(diào)節(jié)、胚胎細胞分化調(diào)節(jié)、凋亡信號通路調(diào)節(jié)、造血功能調(diào)節(jié)、脂肪細胞分化調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，見表3。

表3 CRIP1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的生物過程Go分析Table 3 Gobiological process of CRIP1-interacting protein network

圖3 與CRIP1相互作用的功能蛋白

3 討 論

富含半胱氨酸腸蛋白(cysteine-rich intestinal protein，CRIP)屬于LIM(Lin-1，Isl1，Mec3)蛋白家族的一個亞家族，因富含9%的半胱氨酸而得名。CRIP家族成員包括CRIP1、CRIP2和CRIP3。CRIP1廣泛分布在人體中，如小腸、結(jié)腸、肺、胸腺、脾等，也可通過鋅、細胞因子和激素體外誘導(dǎo)，在真核細胞的生長發(fā)育以及分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[4]。CRIP1基因在腫瘤方面的研究較為熱門，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類宮頸癌、胰腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中高表達分布[9-10]。有文章指出，CRIP1在甲狀腺癌中高表達，并且在腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲過程中扮演致癌基因的角色[5]。有研究證明，CRIP1基因異常表達與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，沉默CRIP1基因能有效抑制腫瘤的遷移和侵襲，有助于結(jié)腸癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移生物標志物的開發(fā)[7]。研究報道了CRIP1在人類宮頸癌進展中的作用，發(fā)現(xiàn)CRIP1在宮頸癌細胞系中高表達，通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路，促進腫瘤細胞遷移和侵襲[8]。以上研究說明CRIP1在多種類型腫瘤進展中發(fā)揮重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點，但是至今并沒有文章報道CRIP1在人類卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中起到怎樣的作用？因此本研究通過采用生物信息學(xué)方法探究CRIP1在卵巢癌中表達水平、與患者生存期的關(guān)系以及相關(guān)生物學(xué)功能。

研究發(fā)現(xiàn)CRIP1在不同類型的腫瘤中差異性表達，102項研究中腫瘤表達呈顯著上升水平，64項研究其表達呈顯著下降水平，但是在6項卵巢癌研究中其腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常卵巢組織，并且在不同病理分型的卵巢癌中，如卵巢漿液性腺癌(卵巢漿液性囊腺癌、卵巢漿液性乳頭狀癌)、卵巢黏液腺癌中均高表達分布，預(yù)示著CRIP1過表達水平對卵巢癌發(fā)生發(fā)展會有重要作用。接下來分析CRIP1基因與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，CRIP1基因高表達的卵巢癌患者總生存期和無進展生存期均顯著降低；根據(jù)不同的臨床特征進行分組，CRIP1表達雖與不同分期和不同分級的卵巢癌患者總生存期無密切相關(guān)性，但是CRIP1高表達的患者在接受紫杉醇、多西他賽、拓撲替康化療后總生存期顯著降低，說明CRIP1高表達的患者應(yīng)合理選擇化療方案，規(guī)避風(fēng)險，說明CRIP1基因高表達是卵巢癌預(yù)后的危險因素，提示CRIP1作為預(yù)后分子診斷標志物具有一定的應(yīng)用前景。為了更好的了解CRIP1蛋白的作用機制以及與其他蛋白的功能聯(lián)系，進一步通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CRIP1相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測20個功能蛋白與CRIP1相互作用，進一步GEPIA數(shù)據(jù)庫分析獲得4個緊密相關(guān)蛋白，通過查閱文獻均在卵巢癌中發(fā)揮作用：STK4，壓力激活的、促凋亡的激酶，是Hippo信號通路的關(guān)鍵成分，STK4/Hippo信號的異常或者缺失會導(dǎo)致機體發(fā)育障礙、致癌作用、癌癥預(yù)后較差等[11-12]；YAP1，作為Hippo信號通路的效應(yīng)因子，在許多癌癥中Yap1的動態(tài)表達會導(dǎo)致表型改變，在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥類型中過表達的Yap1被認為是不良預(yù)后標志物[13-14]；LGALS3，參與多種細胞功能，如細胞凋亡、先天免疫、細胞黏附和T細胞調(diào)節(jié)等，在多種癌癥中表達上調(diào)或下調(diào)，與患者預(yù)后緊密相關(guān)[15-16]；ATOX1，作為抗超氧化物和過氧化氫的抗氧化劑，可能在癌癥的發(fā)生中產(chǎn)生重要作用?；贑RIP1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，進行Go聚類分析發(fā)現(xiàn)CRIP1蛋白參與造血干細胞分化、造血功能、Hippo信號通路以及發(fā)育調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，以上分析提供了CRIP1在卵巢癌中可能的作用機制，明確的機制還需要進一步實驗研究。

本研究通過生物信息學(xué)方法和大數(shù)據(jù)分析從不同層面揭示了CRIP1在卵巢癌中的表達及其臨床意義，研究證明CRIP1高表達與卵巢癌患者預(yù)后負相關(guān)，提示CRIP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演致癌基因的角色，有望成為卵巢癌診治的重要靶點和預(yù)后判斷的關(guān)鍵指標。