劉紅紅，邢寧寧，師麗敏，李愛軍

(河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院呼吸科，河北 邢臺(tái) 054000)

支氣管哮喘是由炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣道慢性炎癥、平滑肌紊亂以及氣道重塑為主要特征，其中氣道重塑是誘發(fā)患者發(fā)生氣道高反應(yīng)性的重要因素，可引發(fā)肺心病、阻塞性肺氣腫等疾病[1]。嗜酸粒細(xì)胞(eosinnophil,EOS)是引發(fā)支氣管哮喘的重要炎癥細(xì)胞，氣道受到過敏原刺激可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)EOS分泌大量的炎性介質(zhì)(如多種白細(xì)胞介素、趨化因子)，進(jìn)而導(dǎo)致支氣管黏膜損傷、功能障礙等[2-3]。戴紹文等[4]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)EOS參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，EOS的細(xì)胞功能活性與氣道炎癥因子分泌密切關(guān)聯(lián)。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(phosphatidylinositol kinase 3/Protein Kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路在調(diào)控機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，該通路的激活可誘導(dǎo)EOS的生長(zhǎng)、增殖、遷移等生物學(xué)過程，特別是促進(jìn)EOS的定向遷移[5]。聚集到氣道的EOS通過產(chǎn)生活性氧而介導(dǎo)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)、DNA的異常生理功能，加劇了支氣管高反應(yīng)性、炎癥反應(yīng)[6]。目前關(guān)于支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系尚未明確，因此，本研究將通過分析臨床樣本進(jìn)行論證，旨在探討EOS與支氣管哮喘患者氣道炎癥的相關(guān)機(jī)制，從而指導(dǎo)新藥開發(fā)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年10月—2020年4月于我院就診的36例氣管哮喘患者作為觀察組，選取同時(shí)段于我院的36例健康體檢者為對(duì)照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)制定的哮喘防治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②臨床表現(xiàn)：肺部可聞及哮鳴音，咳嗽、胸悶、發(fā)作性喘息；③病歷資料完整 。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療前1個(gè)月內(nèi)接受支氣管擴(kuò)張劑、白三烯受體阻滯劑、糖皮質(zhì)激素治療；②心、肝、腎等重要臟器功能障礙；③重癥哮喘、感染和過敏性疾??；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤精神意識(shí)障礙。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 基線資料比較Table 1 Comparison of baseline information (n=36)

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2方法

1.2.1病例資料收集 回顧分析所有患者病歷資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)體積濃度、血清總IgE水平、氣道重塑指標(biāo)等信息，并對(duì)此次研究的病歷資料保密性負(fù)責(zé)。氣道重塑指：氣道壁面積占?xì)獾揽倷M截面積百分比(WA%)=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2×100%，支氣管管壁厚度與外徑比(T/D)，T=(D-L)/2，L、D分別為氣道內(nèi)、外徑?；颊呷虢M后均接受高分辨胸部CT掃描，選取中動(dòng)脈弓和氣管分叉下1 cm、氣管分叉處上1 cm、右肺下靜脈和橫隔頂上 2 cm 處，采用電子標(biāo)尺測(cè)量L、D以及T，均連續(xù)測(cè)量3次取均值。

1.2.2誘導(dǎo)痰細(xì)胞分布 患者吸入沙丁胺醇，10 min后用清水漱口以及高滲鹽水超聲霧化，深咳嗽并將痰液放置于培養(yǎng)皿中，收集密度大、黏稠度高的痰液，稱重后加入二硫蘇糖醇裂解，濾去雜質(zhì)，離心后PBS懸浮，采用臺(tái)盼蘭鑒定細(xì)胞活力。制作細(xì)胞涂片，多聚甲醛固定，染色、烘干、封片，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、EOS)分類。

1.2.3PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Westblot印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。收集誘導(dǎo)痰后，采用梯度離心法分離多形核白細(xì)胞。誘導(dǎo)痰在Ficoll-PaquePLUS淋巴分離液(芬蘭GE Healthcare)中分層，于室溫1 000 g離心30 min，通過EOS、紅細(xì)胞的低滲溶解分離多形核白細(xì)胞，并使用EOS分離試劑盒(美國(guó)MiltenyiBiotek)分離EOS。細(xì)胞液裂解分離后的EOS后，加入總蛋白提取液，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，采用Bradford方法測(cè)定總蛋白濃度，將蛋白質(zhì)量濃度稀釋為5 mg/L。取20 μL蛋白液，變性后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)膜，加入兔抗人Akt、p-Akt、PI3K、β-actin一抗(1∶500)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，采用化學(xué)底物發(fā)光法顯色。采用Image-Qua NT軟件測(cè)量顯色條帶的光密度，計(jì)算各組蛋白相對(duì)β-actin的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson分析EOS與各指標(biāo)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組誘導(dǎo)痰細(xì)胞分布情況 2組誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞分布情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，觀察組EOS占比均明顯高于對(duì)照組，而中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞占比明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組、對(duì)照組誘導(dǎo)痰細(xì)胞分布情況比較Table 2 Comparison of distribution of induced sputum cells in observation group and control group

2.2EOS與氣道重塑指標(biāo)、氣道炎癥標(biāo)志物的關(guān)系 以觀察組患者EOS的均值為臨界值，將觀察組患者分為高EOS組和低EOS組，2組患者的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高EOS組的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表3。

表3 EOS與氣道重塑指標(biāo)、氣道炎癥標(biāo)志物的關(guān)系Table 3 Relationship between eosinophils and airway remodeling and airway inflammation markers

2.3EOS與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系 高EOS組和低EOS組的PI3K、p-Akt表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高EOS組患者的PI3K、p-Akt表達(dá)水平明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表4，圖1。

圖1 PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 EOS與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系Table 4 Relationship between eosinophils and PI3K/Akt signaling pathways

2.4氣道炎癥標(biāo)志物與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系 Pearson分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE分別與PI3K、p-Akt具有正相關(guān)性(P<0.05)，見表5，圖2～5。

表5 氣道炎癥標(biāo)志物與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系Table 5 Relationship between airway inflammatory markers and PI3K/Akt signaling pathways

圖2 FeNO與p-Akt的關(guān)系

圖3 FeNO與PI3K的關(guān)系

圖4 血清總IgE與p-Akt的關(guān)系

圖5 血清總IgE與PI3K的關(guān)系

3 討 論

支氣管哮喘以反復(fù)發(fā)作的咳嗽咳痰、胸悶氣喘等為主要臨床癥狀，反復(fù)發(fā)作可損傷氣道內(nèi)皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)過度增殖，引起氣道狹窄，以及加重氣道高反應(yīng)性和氣流受限，最終危及患者生命安全[8]。哮喘的發(fā)生涉及EOS、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞，其中以EOS最具特征性，臨床研究發(fā)現(xiàn)隨著慢性持續(xù)期患者病情的加重，誘導(dǎo)痰EOS呈增加趨勢(shì)，表明EOS與哮喘病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，通過開展誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)檢查可客觀反映炎癥、氣道狀態(tài)，以及早期評(píng)估病情變化[9]。EOS來源于骨髓CD34+祖細(xì)胞，參與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，如在過敏性鼻炎中EOS通過分泌嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白、酸性粒細(xì)胞過氧化物、主要堿性蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞神經(jīng)毒素等顆粒蛋白而參與炎癥反應(yīng)，如誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的黏附聚集、刺激炎性因子的分泌等[10]。EOS的血管內(nèi)皮遷移涉及滾動(dòng)、牢固黏附、跨內(nèi)皮遷移等過程，主要由黏附分子、趨化因子、細(xì)胞因子間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中PI3K/Akt信號(hào)通路可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞以及炎癥介質(zhì)的形成和釋放，從而引發(fā)氣道變應(yīng)性疾病(支氣管哮喘、過敏性鼻炎等)[11]。研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，EOS的脫顆粒蛋白、增殖、遷移等過程受到抑制，表明PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控EOS的生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組、對(duì)照組誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞分布(EOS、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中觀察組患者EOS占比明顯高于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果一致[13]，表明支氣管哮喘患者中氣道炎癥表型以EOS為主，占比高達(dá)50%，可通過痰液中EOS的計(jì)數(shù)評(píng)估氣道炎癥和區(qū)分炎癥表型。EOS在過敏性氣道炎癥過程中的趨化性可反映炎癥進(jìn)程，如過敏原激發(fā)試驗(yàn)顯示支氣管哮喘患者血液中EOS對(duì)化學(xué)物質(zhì)具有更強(qiáng)的反應(yīng)性，誘導(dǎo)物可增強(qiáng)EOS的趨化性，并刺激釋放毒性顆粒蛋白，引起氣道組織活性氧損傷[14]。FeNO、血清總IgE均是氣道炎癥標(biāo)志物[13]，其中FeNO可評(píng)估患者哮喘炎癥程度和疾病控制水平，以及反映肺功能狀態(tài)，IgE是機(jī)體受到免疫原刺激后產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白，可增加EOS、肥大細(xì)胞的敏感性，刺激炎癥因子分泌，從而加重支氣管哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。本研究表明觀察組患者的氣道炎癥標(biāo)志物(FeNO體積濃度、血清總IgE)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)隨著EOS比例增加，血清總IgE、FeNO體積濃度呈增加趨勢(shì)，表明EOS比例與炎癥標(biāo)志物存在相關(guān)性。另外，觀察組患者的T/D、WA均明顯高于對(duì)照組，與蔣凌志等[15]研究結(jié)果一致，氣道重塑是引起支氣管哮喘持續(xù)惡化的病理基礎(chǔ)，可導(dǎo)致肺纖維化和肺功能降低。高EOS組的T/D、WA均明顯高于低EOS組，分析認(rèn)為EOS誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)可損傷氣道內(nèi)皮組織，刺激平滑肌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞的增生，降低氣道痙攣可逆性，進(jìn)而增加氣道高反應(yīng)性及氣流受限程度，故而導(dǎo)致氣道重塑。

PI3K/Akt 信號(hào)通路可調(diào)控多種免疫細(xì)胞(EOS、肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等)的分化、活化，進(jìn)而參與氣道變應(yīng)性疾病的病理生理過程。本研究顯示，高EOS組的PI3K、p-Akt表達(dá)水平明顯高于低EOS組，進(jìn)一步證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化與EOS的增殖、遷移密切關(guān)聯(lián)。包海鵬等[16]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)下游p-Akt的表達(dá)而調(diào)節(jié)EOS的生物學(xué)過程，EOS通過Eotaxin(可刺激EOS的趨化性)處理可激活PI3K/Akt 途徑，促進(jìn)EOS的增殖、遷移和脫顆粒蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)。同時(shí)本次研究通過Person相關(guān)性分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE與PI3K、p-Akt具有正相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號(hào)通路活化程度具有相關(guān)性。Huang等[17]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道周圍浸潤(rùn)著大量的炎癥細(xì)胞，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后可阻斷炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎癥因子的表達(dá)(纖維連接蛋白1、I型膠原等)，以及增加黏鈣蛋白的表達(dá)，從而阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減輕哮喘患者氣道重塑過程。PI3K信號(hào)通路還可以通過刺激氣道平滑肌細(xì)胞的增殖以及調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期而加重支氣管哮喘氣道炎癥反應(yīng)，另外，哮喘動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及支氣管哮喘患者的臨床觀察均能發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)通路的異?；罨彝ㄟ^PI3K抑制劑處理后可明顯抑制支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步表明PI3K/Akt信號(hào)通路與支氣管哮喘的炎癥、氣道重塑等病理過程密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述，支氣管哮喘患者的EOS的PI3K/Akt信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，與氣道炎癥(FeNO、血清IgE)具有正相關(guān)性。