羅林玉，張譽籍，趙繼凱，徐銀麗，于立明，薛曉東，王輝山

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044

心力衰竭是影響心臟的多種疾病的最終途徑，發(fā)病率為1%～2%[1-2]。淀粉樣蛋白沉積是心力衰竭的潛在病因[3]，可發(fā)生在心室和心房，以及血管(特別是小血管)周圍和瓣膜，傳導(dǎo)系統(tǒng)也可能牽涉其中[4]。淀粉樣蛋白存在于全身，包括心肌、腎上腺、腎、肺、脾及周圍神經(jīng)等。本研究旨在觀察心臟移植心力衰竭患者心臟標(biāo)本中的淀粉樣蛋白沉積情況?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自2013年1月至2021年2月因風(fēng)濕性心臟病進行瓣膜置換術(shù)的35例患者(風(fēng)濕性心臟病組)和因終末期心力衰竭進行心臟移植的35例患者(心力衰竭組)為研究對象。兩組患者均由同一術(shù)者進行手術(shù)。風(fēng)濕性心臟病組納入標(biāo)準(zhǔn)：患有風(fēng)濕性心臟瓣膜??；左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)>0.4；心功能Ⅰ～Ⅱ級；臨床診斷達(dá)到瓣膜置換術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。心力衰竭組納入標(biāo)準(zhǔn)：心臟疾病已到晚期；LVEF<0.4；心功能Ⅲ～Ⅳ級；臨床診斷達(dá)到心臟移植標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(KGIHC001)、一步法免疫組化試劑盒(KGOS60)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；APP(#2452)、GAPDH(14C10)、β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)(1-42)(D9A3A)、Aβ(1-40)(D8Q71)購自美國CST公司；辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(abs20040)、剛果紅(abs42221387)購自北京愛必信生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液(DA-1015)、DAPI(C0065)購自北京索萊寶公司；Masson三色染色液(BA-4079B)購自貝索公司；鹽酸乙醇快速分化液(C0163S)、BCA試劑盒(P0010)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯影液(P10300)購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器 低溫高速臺式離心機(Neofuge23R)購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；超低溫冰箱(DW-86W420)購自青島海爾股份有限公司；Multiskan23R FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；Bio-Rad凝膠蛋白分離系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；凝膠曝光系統(tǒng)購自Tanon公司；石蠟包埋機(EG1150H+EG1150C)購自Leica公司；制冰機(YT-IMS-45)購自恒隆儀器有限公司；激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2)購自日本Nikon公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料 收集并記錄患者的年齡、住院天數(shù)、性別、超聲心動圖檢查結(jié)果，以及氨基末端腦利鈉肽(N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)水平。

1.3.2 免疫組化 分別從風(fēng)濕性心臟病組和心力衰竭組隨機選取10例患者，收集左室標(biāo)本。將標(biāo)本制成4 μm厚度的切片。采用SP免疫組化法進行染色。脫蠟修復(fù)后滴加Aβ1-40抗體(1∶200)、Aβ1-42抗體(1∶200)，4℃冰箱孵育過夜。次日取出復(fù)溫，生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育20 min，滴加現(xiàn)配DAB進行顯色。目標(biāo)抗體表達(dá)顯示為棕色，表達(dá)量以其占整個觀察視野的面積百分比表示。

1.3.3 Western Blot 收集待測組織，離心后留取細(xì)胞沉淀于1.5 ml EP管中，提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，對各樣品進行蛋白定量，置入100℃沸水中5 min，冷卻后-80℃保存。采用8%的SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，配制濃縮膠電泳1 h，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，APP抗體(1∶1 000)4℃過夜，次日TBST洗滌5次，每次8 min，二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗滌5次，每次8 min，ECL顯色發(fā)光，照相。

1.3.4 Masson染色 將切片脫蠟至水，采用馬松三色染色法進行染色。染色后，肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色或綠色。

1.3.5 剛果紅染色 將切片脫蠟至水，采用High-man甲醇剛果紅染色法進行染色。染色后，心肌組織標(biāo)本中的淀粉樣纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3.6 免疫熒光染色 將切片4.0%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100打孔、5.0% BSA封閉1 h后，滴加Aβ1-42抗體(1∶50)，4℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，每次5 min，避光加FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶50)，室溫孵育1 h。DAPI對細(xì)胞核進行染色，滴加甘油進行封片，低溫避光保存。激光共聚焦顯微鏡成像觀察。染色后，Aβ呈綠色，DAPI呈藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料 風(fēng)濕性心臟病組中，男性27例，女性8例；年齡(58.92±12.13)歲；住院天數(shù)(22.51±6.69)d；LVEF(54.51%±10.86%)；NT-proBNP (1 515.54±1 297.10)pg/ml。心力衰竭組中，男性29例，女性6例；年齡(51.43±10.41)歲；住院天數(shù)(27.71±21.51)d；LVEF(33.15%±12.57%)；NT-proBNP (4 437.00±3 138.00)pg/ml。

2.2 兩組Aβ表達(dá)水平比較 心力衰竭組Aβ表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 兩組Aβ表達(dá)水平比較(剛果紅染色；a.風(fēng)濕性心臟病組，b.心力衰竭組)圖2 兩組Aβ表達(dá)水平比較(免疫熒光染色；a.風(fēng)濕性心臟病組，b.心力衰竭組)

圖3 兩組Aβ表達(dá)水平比較(免疫組化)

2.3 兩組膠原纖維表達(dá)水平比較 心力衰竭組膠原纖維表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 兩組膠原纖維表達(dá)水平比較(Masson染色)

2.4 兩組APP表達(dá)水平比較 心力衰竭組APP表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 兩組APP表達(dá)水平比較(Western Blot)

3 討論

淀粉樣變性是淀粉樣蛋白原纖維在多個器官中的細(xì)胞外沉積而引起的一組疾病。淀粉樣纖維主要成分為心房鈉尿肽及其前體形式的氨基末端部分[5]。Sanbe等[6]研究指出，淀粉樣寡聚體存在于人類心力衰竭患者心肌細(xì)胞和動物結(jié)蛋白相關(guān)心肌病模型中。心臟作為內(nèi)分泌器官，可產(chǎn)生心房鈉尿肽[7-8]和腦利鈉肽[9]，兩者通過激活鳥苷酸環(huán)化酶A受體，促進第二信使3’，5’-環(huán)鳥苷一磷酸生成[10]，介導(dǎo)心肌保護及代謝功能，如抑制心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化、增強舒張功能、促進脂肪分解和白色脂肪細(xì)胞褐化等[11]。心房鈉尿肽和腦利鈉肽水平升高是心力衰竭的一個標(biāo)志[12]。NT-proBNP是腦利鈉肽前體降解后的化學(xué)結(jié)構(gòu)之一，可用于診斷心力衰竭。本研究中，心力衰竭組患者NT-proBNP水平明顯升高。

APP是β-淀粉樣前體蛋白，在體內(nèi)代謝為Aβ，細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)Aβ(包括單體、寡聚及纖維形式)之間會通過多種機制引起小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、活性氧產(chǎn)生及突觸損傷等[13]。心肌中含有豐富的心臟成纖維細(xì)胞，約占心臟細(xì)胞群的10%～20%[14]。持續(xù)不斷的肌成纖維細(xì)胞活化驅(qū)動會引起過度纖維化，導(dǎo)致心臟組織順應(yīng)性下降，營養(yǎng)和氧氣輸送減少，心肌細(xì)胞萎縮及死亡，誘發(fā)進行性左室擴張和功能障礙[15-17]。本研究中：經(jīng)剛果紅染色、免疫熒光染色、免疫組化，心力衰竭組均出現(xiàn)Aβ表達(dá)，且表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Masson染色可見心力衰竭組膠原纖維表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Western Blot提示，心力衰竭組APP表達(dá)水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此推測，心力衰竭患者心肌中出現(xiàn)Aβ沉積可能與心肌纖維化有關(guān)，而這個過程可能由APP相關(guān)通路介導(dǎo)[18]。

綜上所述，心力衰竭的心臟移植患者出現(xiàn)心肌淀粉樣變性和心肌纖維化現(xiàn)象，心肌中Aβ沉積可能與心肌纖維化有關(guān)，且這個過程可能由APP相關(guān)通路介導(dǎo)。