朱朝鋒,時盼來,焦智慧,孔祥東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 450052

22q11.2微缺失綜合征(22q11.2DS)是人類最常見的染色體微缺失綜合征，發(fā)病率為1/4 000～1/2 000[1]，由于其臨床表型多樣且部分表型不典型，以及分子診斷技術(shù)的滯后，實(shí)際發(fā)生率可能更高。22q11.2DS大部分是由于非等位基因同源重組導(dǎo)致的新發(fā)變異，位于染色體22q11.2區(qū)域有0.7～3.0 Mb片段雜合性缺失，累及多系統(tǒng)異常表現(xiàn)，是引起先天性心臟病、發(fā)育遲緩和腭裂綜合征的常見遺傳性疾病[1]。22q11.2DS在胎兒中的患病率約為1/1 000，如有心臟檢測結(jié)果異常，則發(fā)病率可高達(dá)1/100[2-3]。因此,對于22q11.2DS的早期診斷和預(yù)防具有多種優(yōu)勢，能夠極大地減少醫(yī)療、情感和社會成本。目前，針對22q11.2DS進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法主要包括染色體微陣列分析(CMA)/全基因組拷貝數(shù)變異檢測(CNV-seq)、熒光原位雜交(FISH)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)等。但由于國內(nèi)外關(guān)于22q11.2DS的研究主要著眼于出生后人群，在產(chǎn)前診斷方面的報(bào)道較少，22q11.2DS表型多種多樣，仍然缺乏統(tǒng)一的篩查標(biāo)準(zhǔn)，而且90%以上為新發(fā)突變，臨床上難以針對性地進(jìn)行產(chǎn)前診斷。近年來，全外顯子組測序(trio-WES)技術(shù)應(yīng)用于超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的產(chǎn)前診斷的報(bào)道越來越多[4-8]。trio-WES檢測作為一種有效、全面的臨床檢測手段，不受表型的影響，可一次性檢測與大多數(shù)疾病相關(guān)的基因變異，陽性檢出率提高至30%～60%。本研究通過trio-WES技術(shù)診斷出1例22q11.2DS，并通過CNV-seq方法進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦，25歲，孕2產(chǎn)0，因2次胎兒超聲異常妊娠史來本科室進(jìn)行遺傳咨詢。第1次，孕24周超聲提示胎兒心內(nèi)膜墊缺失而終止妊娠；第2次，孕20+6周胎兒肺動脈閉鎖伴室間隔缺損經(jīng)遺傳咨詢后決定終止妊娠。夫妻2人非近親結(jié)婚，身體健康，染色體核型檢測均正常(圖1)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號Ks-2018-KY-36)，家系成員均知情同意并簽署知情同意書。

注：A為孕婦染色體結(jié)果46,XX,22ps+，箭頭所示22號染色體隨體增加；B為配偶染色體檢查結(jié)果46,XY。

1.2基因組DNA的提取 采集孕婦及其配偶的外周血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，同時采集引產(chǎn)胎兒皮膚組織，按照QIAamp DNA提取試劑盒操作說明提取全基因組DNA，TE溶液洗脫DNA，并利用NanoDrop紫外分光光度儀測定DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，得出其濃度及純度，保持A260/A280在1.7～2.0。

1.3trio-WES檢測 trio-WES檢測由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。簡要過程如下：將提取的基因組DNA打斷成250 bp左右片段，經(jīng)末端修復(fù)、接頭連接、純化后利用IDT xGen?Exome Research Panel試劑盒進(jìn)行全外顯子片段捕獲，構(gòu)建測序文庫。使用Illumina NovaSeq測序儀(美國Illumina公司)進(jìn)行讀長為150 bp的雙端高通量測序，測序數(shù)據(jù)通過質(zhì)控后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測序數(shù)據(jù)通過Cruxome全外數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(北京貝瑞基因公司)進(jìn)行分析。查閱OMIM、ClinVar、HGMD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行已知或疑似致病突變篩選，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會發(fā)布的序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南[9]對變異進(jìn)行分級，綜合判斷變異的致病性。同時對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行外顯子捕獲區(qū)域基因拷貝數(shù)變異(CNV)分析。同批次樣本的全外測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后均一化計(jì)算，分析外顯子水平的拷貝數(shù)變化。最后根據(jù)ACMG指南對CNV進(jìn)行評估和致病性分類。

本研究對孕婦本人、配偶及胎兒全外顯子組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析未檢測到相關(guān)致病性單堿基轉(zhuǎn)換/顛換(SNV)、缺失突變(InDel)變異，但是通過對捕獲區(qū)域CNV進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胎兒22q11.2區(qū)域有約1.41 Mb的雜合性缺失片段(chr22:18893882-20307516)和0.86 Mb的雜合性缺失片段(chr22:20706067-21563420)，變異均來自父親。

1.4CNV-seq 提取并純化后的基因組DNA通過北京貝瑞和康公司科諾安試劑盒進(jìn)行建庫。構(gòu)建好的文庫通過Nextseq CN500測序平臺進(jìn)行單端測序產(chǎn)生8M 36 bp reads，約為0.1X全基因組測序深度。測序數(shù)據(jù)提交至科諾安分析平臺進(jìn)行CNV-seq分析。通過CNV-seq方法對胎兒及配偶的全外顯子組測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胎兒22q11.2區(qū)域有約2.58 Mb的雜合性缺失片段(chr22:18900000-21480000)，與配偶的檢測結(jié)果相同。

2 討 論

22q11.2DS的臨床表型復(fù)雜多樣，給臨床診斷帶來巨大挑戰(zhàn)，22q11.2DS的發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚。22q11.2區(qū)域復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)導(dǎo)致生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時易發(fā)生非同源基因同源重組(NAHR)，NAHR可引起22q11.2再發(fā)性缺失[1,10]。大約90%的患者有3 Mb大小的典型缺失區(qū)域，8%存在1.5 Mb的微小缺失，另外還有一些不典型的小片段缺失和遠(yuǎn)端缺失。本研究檢測的胎兒22q11.2DS缺失區(qū)域大小約為2.58 Mb(chr22:18900000-21480000)，屬于典型缺失區(qū)域。胎兒存在先天性心臟結(jié)構(gòu)畸形，且該家系存在2次胎兒心臟畸形不良孕產(chǎn)史，疾病與22q11.2DS表型相符。本研究中胎兒22q11.2缺失區(qū)域遺傳來自父親，但父親表型正常。1例22q11.2DS(chr22:21060359-21461607,hg19)缺失患者主要的臨床表征為重度運(yùn)動和認(rèn)知障礙、脊柱裂、脊柱側(cè)彎、巨頭畸形、腦積水、小腦發(fā)育不全、特殊面容等，其母親攜帶此缺失片段，無明顯臨床表征[11]。1例22q11.2DS(chr22:21046144-21460009,hg19)缺失患者主要的臨床表征為運(yùn)動延遲、智力障礙、新生兒肌張力減退、腦癱等，其母親攜帶此缺失片段，無明顯臨床表征[12]。因此，22q11.2DS表型的多樣性被認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

22q11.2DS尚無有效的治療手段，目前主要是針對其表型(如低鈣血癥、T細(xì)胞功能缺陷、心臟發(fā)育異常、學(xué)習(xí)和語言能力低下等)進(jìn)行對癥治療。因此，對22q11.2DS進(jìn)行早期診斷和干預(yù)及遺傳咨詢是預(yù)防該病發(fā)生的關(guān)鍵。22q11.2DS發(fā)病率高，僅次于唐氏綜合征，但由于其臨床表型復(fù)雜，國內(nèi)對該病的認(rèn)識不足，未能建立完善的篩查體系，臨床上很多病例仍不能得到確診。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)是22q11.2DS經(jīng)典的檢測方法，但是其操作相對煩瑣且分辨率十分有限。微陣列芯片(包括微陣列比較基因組雜交或單核苷酸多態(tài)性微陣列等)能夠更精確地了解缺失片段的長度，多重連接探針擴(kuò)增檢測相對更加簡單快速且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，更適合于對先證者確診后的家系驗(yàn)證。微陣列芯片及近年來發(fā)展的CNV-seq雖能對全基因組范圍內(nèi)微缺失微重復(fù)進(jìn)行檢測，但其分辨率為100 kb，對于點(diǎn)突變、小片段缺失/重復(fù)所致的單基因疾病無法檢測。

trio-WES技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床遺傳病的檢測，但其主要針對相關(guān)基因編碼區(qū)序列的SNV和50 bp以內(nèi)插入InDel，對于染色體拷貝數(shù)變異水平的檢測效能還缺乏明確結(jié)論。本研究顯示，利用trio-WES技術(shù)檢測22q11.2DS被認(rèn)為是可行的，并且與當(dāng)前其他現(xiàn)存檢測技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢。trio-WES可一次性檢測人類基因組中約20 000個目標(biāo)基因，分析相關(guān)的致病性SNV、InDel變異，同時還能對捕獲區(qū)域進(jìn)行CNV分析，縮短診療時間，將陽性檢出率提升至30%～60%。22q11.2DS胎兒期臨床表現(xiàn)不明確，目前報(bào)道的主要是超聲檢查可見先天性心臟缺陷，其中圓錐動脈干缺陷最常見，其他還有血管異常和左心發(fā)育不良。胸腺異常、泌尿系統(tǒng)缺陷及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常也有報(bào)道[11]。大多數(shù)結(jié)構(gòu)異常要在18～24周通過超聲才能檢測到，因此要求能夠盡快明確診斷。胎兒表型通常不明確，所以trio-WES檢測可能是目前實(shí)現(xiàn)快速診斷的最有效的檢測方案[12]。目前，關(guān)于trio-WES檢測拷貝數(shù)變異的報(bào)道還較少，張彥[13]報(bào)道了2例遺傳病家系通過trio-WES發(fā)現(xiàn)染色體拷貝數(shù)變異，片段大小從11.4 kb至13.03 Mb不等，結(jié)果得到了CMA等技術(shù)的驗(yàn)證。

總之，本研究通過trio-WES技術(shù)對2次孕中期超聲心臟發(fā)育異常的家系進(jìn)行測序，對檢測發(fā)現(xiàn)的22q11.2DS缺失區(qū)域進(jìn)行了遺傳學(xué)分析和CNV-seq驗(yàn)證，明確了22q11.2DS約2.58 Mb雜合性缺失是其致病性變異，為該夫婦進(jìn)行再次生育給予指導(dǎo)并提供了有效的遺傳咨詢。trio-WES技術(shù)應(yīng)用于22q11.2DS的基因診斷是可行的。trio-WES技術(shù)應(yīng)用于其他微缺失微重復(fù)綜合征還需要更多的數(shù)據(jù)評估和驗(yàn)證。