陳家亮 周向東,2,3 李琪 鐘有清 劉鋒 陳小妹

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?570102；2.急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院海島急救醫(yī)學(xué)創(chuàng)新單元，海南 ?？?571199；4.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570102)

哮喘以氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、氣道重塑為主要特征，表現(xiàn)為氣道黏液過(guò)度分泌、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)，導(dǎo)致肺功能下降[1-2]。哮喘病因復(fù)雜，多數(shù)患者接觸過(guò)敏原后產(chǎn)生免疫反應(yīng)，繼而引起氣道變異性炎癥反應(yīng)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(Endoplasmic Reticul Stress，ERS)參與多種炎癥和過(guò)敏性疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，影響蛋白質(zhì)正確折疊，促進(jìn)肺部炎癥，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)和功能異常。研究ERS在哮喘中的作用機(jī)制，有助于尋找治療哮喘的新靶點(diǎn)[3-4]。黏蛋白5AC(Mucin5AC，MUC5AC)是由杯狀細(xì)胞分泌的一種黏蛋白，是氣道黏液的主要成分，在哮喘患者體內(nèi)異常高表達(dá)[5]。ERS及MUC5AC與哮喘關(guān)系密切，但MUC5AC初期介導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的確切機(jī)制尚不明確[6]。本研究通過(guò)觀察哮喘大鼠氣道上皮MUC5AC表達(dá)，旨在探討其轉(zhuǎn)移入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，7周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物試驗(yàn)的倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑和儀器 卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁[Al(OH)3]、4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)、乙酰甲膽堿(美國(guó)Sigma公司)；含Sec61小干擾RNA(Small Interfering RNA，siRNA)及無(wú)意義隨機(jī)對(duì)照序列的pGCsilencer U6重組質(zhì)粒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；大鼠白介素-4(Interleukin，IL-4)、干擾素-γ(Interferon-γ，INF-γ)ELISA試劑盒、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-Regulated Protein 78，GRP78)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP Homologous Protein，CHOP)、Sec61多抗、山羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Abcam公司)；420 AI超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；動(dòng)物氣道高反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Buxco公司)；BC-500全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.3 建模、分組及干預(yù) 隨機(jī)取50只大鼠建立哮喘模型[7]：分為對(duì)照組、OVA組、siRNA組、陰性對(duì)照(Negative Control，NC)組及4-PBA組，每組10只。1 g OVA+1 g Al(OH)3溶于PBS中制成致敏液，除對(duì)照組外，其他各組分別于雙足、雙側(cè)腹股溝及腹腔皮下注射致敏液，每點(diǎn)注射200 μL，每周1次，連續(xù)2周；第3周開(kāi)始，于霧化箱內(nèi)進(jìn)行霧化激發(fā)，將含有1% OVA的PBS溶液以霧化量0.8 mL/min進(jìn)行霧化，20 min/d，連續(xù)4周。對(duì)照組以PBS代替致敏和激發(fā)。以出現(xiàn)典型哮喘癥狀、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了此次模型均建立成功[8]。根據(jù)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，第3周開(kāi)始，每周第1次激發(fā)前，分別將200 μL含有pGCsilencer U6-Sec61shRNA、pGCsilencer U6-Sec61shRNA-NC質(zhì)粒的質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注入siRNA組、NC組大鼠體內(nèi)，同時(shí)灌胃2 mL/kg生理鹽水；對(duì)照組和OVA組按200 μL/只尾靜脈注射PBS，同時(shí)灌胃2 mL/kg生理鹽水；4-PBA組按2 mL/kg(1 g/kg)腹腔注射4-PBA，同時(shí)尾靜脈注射200 μL PBS，作為陽(yáng)性對(duì)照，各組均連續(xù)干預(yù)4周。

1.4 氣道高反應(yīng)性檢測(cè)[9]分別用3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL濃度乙酰甲膽堿霧化激發(fā)哮喘，測(cè)定大鼠氣道高反應(yīng)性Penh值變化。

1.5 肺泡灌洗液(BALF)指標(biāo)檢測(cè) 灌洗肺泡，收取BALF[10]。離心取上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清IL-4、IFN-γ濃度。取BALF沉淀，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比。

1.6 肺部病理組織學(xué)變化 取右肺，4%多聚甲醛中固定24 h，酒精脫水、石蠟包埋、HE染色，封片，鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.7 Western blot檢測(cè) 呼吸道上皮組織冰上研磨，離心取上清，測(cè)定蛋白濃度，變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗過(guò)夜，洗膜，室溫孵育二抗2 h，洗膜，ECL顯影，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組激發(fā)前后狀態(tài)無(wú)明顯改變；OVA組大鼠煩躁不安、抓耳撓腮、打噴嚏、咳嗽、呼吸急促等，口鼻、四肢輕度發(fā)紺，NC組與OVA組相似；siRNA組、4-PBA組較OVA組有所減輕。

2.2 氣道Penh值比較 OVA組各Penh值高于對(duì)照組(P<0.05)；siRNA組、4-PBA組各Penh值低于OVA組(P<0.05)。各組Penh值隨著乙酰甲膽堿濃度升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)Penh值比較

2.3 BALF中細(xì)胞分類 OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)百分比、淋巴細(xì)胞百分高于對(duì)照組(P<0.05)；siRNA組、4-PBA組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)百分比、淋巴細(xì)胞百分比低于OVA組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 BALF細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 BALF中IL-4、IFN-γ水平比較 OVA組BALF上清中IL-4高于對(duì)照組，IFN-γ低于對(duì)照組(P<0.05)；siRNA組、4-PBA組BALF上清中IL-4低于OVA組，IFN-γ高于OVA組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 BALF中IL-4、IFN-γ水平比較

2.5 肺部病理學(xué)觀察 對(duì)照組支氣管黏膜上皮完整，結(jié)構(gòu)正常；OVA組杯狀細(xì)胞增生，支氣管管壁增厚，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；NC組病理模型與OVA組相似；siRNA組及4-PBA組較OVA組有所改善，仍可見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織病理學(xué)觀察(HE×200)

2.6 相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 OVA組Sec61、GRP78、Chop、MUC5AC表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)；siRNA組、4-PBA組Sec61、GRP78、Chop、MUC5AC表達(dá)低于OVA組(P<0.05)，見(jiàn)表4，圖2。

表4 相關(guān)蛋白水平比較

圖2 蛋白印跡

3 討論

多種因素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞，細(xì)胞錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積滯，從而啟動(dòng)一系列信號(hào)通路，細(xì)胞停止正確合成蛋白質(zhì)，甚至引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致ERS，采用ERS抑制劑4-PBA干預(yù)，可減輕動(dòng)物氣道炎癥，緩解哮喘癥狀[11-13]。正常情況下，MUC5AC通過(guò)物理和化學(xué)屏障發(fā)揮防御保護(hù)上皮細(xì)胞作用，在病原或炎癥等因素刺激下，表達(dá)過(guò)度增加，后期經(jīng)硫化和糖基化修飾，引起黏液過(guò)度分泌，形成黏液栓，阻塞氣道，增加氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能下降[14-15]。MUC5AC后期修飾機(jī)制已有報(bào)道[16]，但大量需折疊修飾的MUC5AC雛形肽初始階段如何介導(dǎo)轉(zhuǎn)移入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的確切機(jī)制尚不明確。GRP78、Chop被認(rèn)為是ERS標(biāo)志性蛋白，在哮喘患者血清中的表達(dá)明顯高于正常人群[17]。本研究模型組中GRP78、Chop表達(dá)升高，表明ERS與哮喘關(guān)系密切。哮喘如何引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白增多，ERS與哮喘之間作用機(jī)制尚未明確，故本研究旨在探討ERS對(duì)哮喘的作用機(jī)制。

核糖體合成的新生肽鏈由于N端帶有正電荷，難以進(jìn)入疏水的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，需要蛋白通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，Sec61三聚體復(fù)合物通過(guò)形成疏水通道調(diào)節(jié)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，使其進(jìn)行正確折疊，是ERS調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Sec61突變引起蛋白通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變，導(dǎo)致ERS[18-20]。本研究成功建立哮喘大鼠模型，OVA組Sec61蛋白表達(dá)顯著升高，提示哮喘可誘導(dǎo)Sec61表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建Sec61干擾序列，OVA組Sec61蛋白表達(dá)顯著下降，表明干擾序列構(gòu)建成功；干擾Sec61后，大鼠氣道高反應(yīng)性Penh值、BALF中IL-4水平及淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著降低，IFN-γ顯著升高，肺組織病理變化得到改善，GRP78、Chop蛋白表達(dá)顯著下降，提示Sec61參與哮喘ERS，通過(guò)敲降Sec61，可減輕哮喘炎癥反應(yīng)，改善肺部病變，降低ERS。肝細(xì)胞脂肪變中Sec61異常高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞ERS，抑制Sec61表達(dá)可減輕脂肪變程度[21]。未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)增加，促使Sec61表達(dá)增加，以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。研究表明，PM2.5誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞中Sec61高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)ERS[22]。Sec61在調(diào)控ERS中發(fā)揮重要作用，本研究敲降Sec61后，可明顯減輕哮喘癥狀，表明Sec61參與調(diào)控哮喘ERS，與哮喘發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。

炎癥等因素誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液分泌增加，MUC5AC是氣道黏液栓最主要大分子組成部分，患者體內(nèi)MUC5AC表達(dá)顯著升高，黏液分泌過(guò)度增加，阻塞氣道，引起肺結(jié)構(gòu)和功能改變，MUC5AC阻塞氣道是引起致命性哮喘的主要原因[23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，MUC5AC在哮喘小鼠模型中表達(dá)異常升高，與哮喘炎癥病理密切相關(guān)[24]。抑制人氣道上皮細(xì)胞MUC5AC分泌可有效減少黏液分泌，減輕炎癥反應(yīng)[25]。本研究敲降Sec61后，MUC5AC蛋白表達(dá)顯著下降，表明敲降Sec61表達(dá)可抑制哮喘過(guò)程中MUC5AC高表達(dá)，減輕炎癥，改善肺部病變及哮喘癥狀。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)門控蛋白Sec61介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Sec61表達(dá)增加，門控通道開(kāi)放，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)敲降Sec61表達(dá)，調(diào)節(jié)ERS，減少M(fèi)UC5AC轉(zhuǎn)移進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，減少黏液分泌，減輕炎癥，改善肺功能及哮喘癥狀。

4 結(jié)論

ERS參與哮喘發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，敲降Sec61表達(dá)可減輕ERS，降低MUC5AC表達(dá)，改善哮喘大鼠癥狀，本研究結(jié)果可為臨床治療哮喘提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。