李青華 宋靖榮 董焱 呂白于 呂偉

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院兒科，上海 201900)

哮喘是小兒常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。哮喘病情易反復發(fā)作，難以治愈，給患者后期生活、學習帶來極大影響[1-2]。哮喘主要病理特征是持續(xù)的氣道炎癥，氣道高反應性和氣道重塑等，氣道平滑肌細胞參與氣道炎癥反應，且平滑肌細胞的增殖是哮喘氣道重塑的特征性改變，其在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[3-5]。故促進氣道平滑肌細胞的凋亡及減輕其引起的炎癥反應對哮喘的治療具有重要意義。研究表明，lncRNA可以調控哮喘氣道炎癥和氣道重塑，有希望成為診斷和治療哮喘的新型靶點[6]。長非編碼RNA牛磺酸上調基因1(lncRNA TUG1)在哮喘大鼠模型中表達水平升高；lncRNA TUG1促進了氣道平滑肌細胞(ASMC)的增殖和遷移，并減少了細胞凋亡[7]。抑制lncRNA TUG1可通過miR-34c/BRD4軸減輕香煙煙霧提取物在慢性阻塞性肺疾病中引起的炎癥損傷[8]。lncRNA TUG1高表達通過調節(jié)miR-21 / PTEN軸促進血管平滑肌細胞的增殖和動脈粥樣硬化[9]。干擾lncRNA TUG1可緩解脂多糖誘導的炎癥反應[10-11]。然而lncRNA TUG1對ASMC中炎癥因子的影響及其機制尚不清楚。miR-326可抑制TGF-β1處理的ASMC的基質蛋白沉積和細胞增殖[12]。抑制circHIPK3可通過miR-326 / STIM1軸抑制ASMC的增殖，遷移并上調細胞凋亡[13]。miR-326在體內可減輕CCl4誘導的小鼠的肝纖維化和炎癥[14]。本實驗通過在線軟件預測顯示，lncRNA TUG1與miR-326有互補的核苷酸結合位點。因此，本實驗旨在探討lncRNA TUG1是否通過調控miR-326影響ASMC的凋亡和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年1月～2020年6月我院收治的支氣管哮喘患兒和非哮喘患兒各9例，年齡5～15歲，平均8歲；從接受了肺切除術的患兒中獲得氣管段，分離出氣道平滑肌束；以非哮喘患兒組織為對照組，所有患兒及家屬均知情同意。

1.2 細胞與主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(貨號：120026，北京凱瑞基生物科技有限公司)；Trizol試劑(貨號：5301100，杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)；熒光定量試劑盒(貨號：QPG-052，上海吉瑪制藥技術有限公司)；凋亡檢測試劑盒(貨號：QN1317-CAT，北京百奧萊博科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：QCB-3201-1，上海欽誠生物科技有限公司)；IL-4、IL-5、IL-13酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號：E-EL-H0101c、E-EL-H0191c、E-EL-H0104c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：GM-040502A，上海澤葉生物科技有限公司)。

1.3 氣道平滑肌細胞(ASMCs)分離培養(yǎng) 無菌條件下將支氣管哮喘患兒的氣道平滑肌束，剪成1 mm3的組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶的底部，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d后可見從組織塊邊緣爬出少量細胞，隨后開始貼壁生長，待細胞長滿瓶底80%左右時，倒置顯微鏡下觀察細胞，細胞呈長梭形，成峰谷生長狀；然后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取穩(wěn)定傳代4～6代的細胞用于實驗。

1.4 細胞轉染與分組 取對數(shù)生長期ASMCs，將TUG1干擾載體及其陰性對照質粒、miR-326模擬物及其陰性對照轉染至ASMCs中，記為si-NC組、si-TUG1組、miR-mimics-NC組、miR-326-mimics組；將TUG1干擾載體陰性對照質粒與miR-326抑制劑陰性對照質粒共轉染，TUG1干擾載體分別與miR-326抑制劑及其陰性對照分別共轉染至ASMCs中，分別記為si-NC+miR-inhibitor-NC組、si-TUG1+miR-inhibitor-NC組及si-TUG1+miR-326 inhibitor組。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TUG1和miR-326表達水平 提取氣道平滑肌組織及細胞的總RNA，反轉錄成cDNA后按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，其中TUG1和miR-326分別以GAPDH和U6為內參，PCR反應體系：2 μL反轉錄產物、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL，7 μL無菌水；循環(huán)條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。最后相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)48 h，用預冷的PBS漂洗，用結合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻避光孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 蛋白質印跡(Western blot)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶800)4℃孵育過夜；加入二抗(1∶1000)室溫孵育2 h；顯影、定影、成像，用Quantity One凝膠分析軟件檢測蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內參計算蛋白相對表達水平。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-4、IL-5、IL-13水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 構建TUG1野生型和突變型熒光素酶報告載體WT-TUG1和MUT-TUG1，將其分別與miR-NC和miR-326共轉染至ASMCs中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 TUG1和miR-326在氣道平滑肌組織的表達水平 與非哮喘患兒比較，哮喘患兒的氣道平滑肌組織中TUG1表達水平升高，miR-326表達水平降低(P<0.05)，見表1。

表1 TUG1和miR-326在氣道平滑肌組織的表達水平

2.2 利用RNA干擾技術沉默TUG1后對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響 與si-NC組比較，si-TUG1組TUG1表達水平降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)，見表2，圖1。

表2 沉默TUG1對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

圖1 沉默TUG1對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

2.3 雙熒光素酶實驗 TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補的序列，見圖2。WT-TUG1與miR-326共轉染后的細胞熒光素酶活性降低，MUT-TUG1與miR-326共轉染后的細胞熒光素酶活性無顯著變化，

圖2 TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補的序列

見表3。與si-NC組比較，si-TUG1組TUG1表達水平降低，miR-326表達水平升高(P<0.05)，見表4。

表3 TUG1和miR-326的雙熒光素酶實驗

表4 TUG1靶向負相關

2.4 過表達miR-326對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響 與miR-mimics-NC組比較，miR-326-mimics組miR-326表達水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，見表5，圖3。

表5 過表達miR-326對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

圖3 過表達miR-326對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

2.5 干擾miR-326能逆轉沉默TUG1對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響 與si-NC+miR-inhibitor-NC組比較，si-TUG1+miR-inhibitor-NC組miR-326表達水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)；與si-TUG1+miR-inhibitor-NC組比較，si-TUG1+miR-326 inhibitor組miR-326表達水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高(均P<0.05)，見表6，圖4。

圖4 干擾miR-326能逆轉沉默TUG1對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

表6 干擾miR-326能逆轉沉默TUG1對氣道平滑肌細胞的凋亡及炎癥因子的影響

3 討論

支氣管哮喘是兒童時期最常見的疾病之一，研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNA與炎癥反應以及氣道平滑肌細胞有著密切的聯(lián)系，推斷l(xiāng)ncRNA可能參與調控哮喘的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。已有研究報道lncRNA TUG1影響ASMC的增殖、遷移和凋亡[7]，且lncRNA TUG1還可促進高血壓狀態(tài)下血管平滑肌細胞的增殖和遷移[17]。沉默lncRNA TUG1抑制了ox-LDL處理的血管平滑肌細胞的增殖并促進細胞凋亡[18]。此外，lncRNA TUG1還參與炎癥反應過程，如抑制lncRNA TUG1可抑制TLR4信號通路介導的大鼠脊髓缺血再灌注的炎癥損傷[19]。lncRNA TUG1的下調通過使miR-449b-5p海綿化，從而減輕了缺血再灌注誘導的腎小管上皮細胞的炎癥[20]。TUG1通過靶向結合miR-29b-1-5p調節(jié)MTDH/NF-κB/IL-1β通路減輕脊髓缺血再灌注損傷炎癥損傷[21]。本實驗檢測了哮喘患兒氣道平滑肌組織中TUG1的表達水平，結果顯示TUG1高表達，與以往研究結果相符[7]。進一步沉默lncRNA TUG1的表達，結果顯示，ASMCs中細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低。IL-4、IL-5、IL-13均是炎癥反應啟動和傳遞的必要的因子，通過增加氣道炎癥可加重哮喘[22]。因此，本實驗結果表明沉默lncRNA TUG1不僅可以促進ASMC凋亡，還可抑制炎癥反應。

已有研究報道，miR-326影響ASMC的增殖[12]。本實驗結果顯示，哮喘患兒氣道平滑肌組織中miR-326表達水平降低；而過表達miR-326后，ASMCs中細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，說明過表達miR-326可促進ASMCs凋亡。此外，miR-326還參與細胞炎癥反應有關；如miR-326通過分別靶向TNFSF14和PTBP1來減輕二氧化硅誘導的肺纖維化，從而抑制炎癥并促進自噬活性[23]。miR-326通過下調TLR4抑制巨噬細胞中脂多糖誘導的炎癥和氧化應激[24]。本實驗結果顯示，過表達miR-326后ASMC中IL-4、IL-5、IL-13水平降低；表明過表達miR-326抑制了ASMC的炎癥反應。

為研究lncRNA TUG1與miR-326的關系，本實驗首先通過在線軟件預測，發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1的核酸序列中存在與miR-326互補的序列，說明TUG1可結合miR-326；本研究進一步構建了含miR-326結合位點的TUG1野生型和突變型熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miR-326共轉染至ASMCs中檢測細胞熒光素酶活性，結果顯示W(wǎng)T-TUG1與miR-326共轉染后的細胞熒光素酶活性降低，MUT-TUG1與miR-326共轉染后的細胞熒光素酶活性無顯著變化；且抑制TUG1表達后miR-326表達水平升高；表明TUG1可靶向負調控miR-326的表達。為研究miR-326對TUG1的影響，本實驗在干擾miR-326的同時沉默TUG1，結果顯示，ASMC的凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高；表明而干擾miR-326逆轉了沉默TUG1對氣道平滑肌細胞凋亡及炎癥因子的影響。這表明TUG1可與miR-326相互作用影響氣道平滑肌細胞凋亡及炎癥。

4 結論與啟示

沉默lncRNA TUG1可通過靶向調控miR-326促進哮喘患兒氣道平滑肌細胞凋亡，抑制炎癥因子的釋放。本實驗目前僅在體外進行細胞實驗，還有待于進一步進行體內實驗予以證實。