李文學(xué)，白慧穎，趙宏晶，周潤(rùn)，葛禾敏，陳潤(rùn)梅，崔青曼，袁春營

（天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457）

蝦青素具有很強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)紫外線引起的皮膚病有較好的治療效果，對(duì)糖尿病引起的眼病也有防治作用，在醫(yī)藥、保健、水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[1-2]。目前，市場(chǎng)上有合成蝦青素和天然蝦青素，天然蝦青素已被證實(shí)對(duì)人體健康有益，廣泛用于保健食品和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，合成蝦青素通常用作飼料的添加劑和色素[3-5]。

蝦青素廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類中[6]。雨生紅球藻是公認(rèn)的蝦青素含量最高的生物，高達(dá)4%，在脅迫條件下積累蝦青素[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)溫度、鹽度、光照、氮磷元素等影響雨生紅球藻蝦青素的積累[9-10]。沈雄等[11]發(fā)現(xiàn)鎢酸鈉可以使硝酸還原酶的活性降低，使生物減少對(duì)硝態(tài)氮的吸收，從而達(dá)到氮脅迫的效果。本文采用響應(yīng)面法探討溫度、pH值、NaCl濃度、鎢酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響，以期為雨生紅球藻的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻：中國科學(xué)院水生生物研究所。

改良 MC培養(yǎng)基（modified chalmers agar）：MgSO4·7H2O 100 mg/L、K2HPO420 mg/L、CaCl2·2H2O 54 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.008 2 mg/L、MnCl2·4H2O 0.004 1 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.038 mg/L、CuSO4·5H2O 0.006 mg/L、CoCl2·6H2O 0.005 1 mg/L、H3BO30.061 mg/L、乙二胺四乙酸二鈉 0.019 8 mg/L、KNO3200 mg/L、FeCl3·6H2O 0.0244mg/L，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式蒸汽滅菌器、BSG-250光照培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MIKRO 200R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Hettich公司；PHS-25酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)：北京華興科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.0軟件，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，4個(gè)因素分別為溫度（A）、pH 值（B）、NaCl濃度（C）和鎢酸鈉濃度（D），以蝦青素含量（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Experimental factors and levels of response surface methodology

1.3.2 蝦青素提取與含量的測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻，進(jìn)行雨生紅球藻蝦青素積累條件優(yōu)化試驗(yàn)，7 d后，按照文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定蝦青素含量。取20 mL藻液離心，沉淀洗滌2次，用5%KOH和30%甲醇去除葉綠素，研磨，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）萃?。?5℃水?。?，離心，上清液重復(fù)提取，直至沉淀呈白色。上清液在492nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蝦青素含量：Y=219.43X-0.001，R2=0.999 6（Y 為 492 nm 處吸光值；X為蝦青素含量，mg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

采用四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，共29個(gè)處理組，以蝦青素含量（Y）為響應(yīng)值，方案及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results

根據(jù)表2數(shù)據(jù)結(jié)果，選用Design-Expert 10.0軟件擬合，得到擬合方程：Y=6.63-0.25A-0.27B-0.089C+0.24D+0.065AB+0.22AC+0.12AD+0.10BC-0.12BD-0.31CD-0.46A2-0.79B2-0.42C2-0.56D2。對(duì)回歸方程Y進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 擬合曲線模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of the fitted curve model

根據(jù)方差分析結(jié)果可知，該擬合方程具有極顯著性（P＜0.01），方差失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型中 R2=0.901 6，R2adj=0.803 1，測(cè)量精度為 9.186＞4[13]，說明結(jié)果中有90.16%符合該模型，該方程擬合度良好[14]。由顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，溫度（P＜0.01）、pH 值（P＜0.01）和鎢酸鈉濃度（P＜0.01）對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累線性效應(yīng)極顯著，而NaCl濃度對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累影響不顯著（P＞0.05）。二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2有極顯著影響（P＜0.01）。模型中交互項(xiàng) CD、AB、AC、AD、BC、BD 影響均不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值大小，確定對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累影響的順序?yàn)锽＞A＞D＞C。

2.2 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

方差分析顯示回歸方程擬合度良好，以回歸方程為基礎(chǔ)，采用Design-Expert 10.0軟件繪制各交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累影響的響應(yīng)面與等高線圖，結(jié)果見圖1～圖6。

圖1 溫度和pH值交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.1 The effect of the interaction of temperature and pH value on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

圖2 溫度和NaCl濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.2 The interaction of temperature and NaCl concentration on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

圖3 溫度和鎢酸鈉濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.3 The interaction of temperature and sodium tungstate concentrations on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

圖4 pH值和NaCl濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.4 The interaction of pH value and NaCl concentration on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

圖5 pH值和鎢酸鈉濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.5 The effect of interaction between pH value and sodium tungstate concentration on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

圖6 NaCl濃度和鎢酸鈉濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.6 The effect of the interaction of NaCl concentration and sodium tungstate concentration on the accumulation of astaxanthin in H.pluvialis

從圖1可以看出，隨著溫度和pH值的升高，蝦青素含量也隨之增加，當(dāng)溫度和pH值升高到一定程度時(shí)，蝦青素含量達(dá)到最大值，溫度和pH值繼續(xù)升高時(shí)，蝦青素含量又會(huì)降低，這說明當(dāng)溫度和pH值取得某個(gè)適中值時(shí)，蝦青素含量達(dá)到最大值。同理，圖2～圖6的因素和響應(yīng)值之間也存在類似的規(guī)律。

通過Design-Expert 10.0分析優(yōu)化，并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行調(diào)整，確定雨生紅球藻蝦青素積累的最佳工藝條件：溫度27℃、pH9.6、NaCl濃度1.7 g/L、鎢酸鈉濃度5.2 mmol/L，此時(shí)蝦青素含量預(yù)測(cè)值為6.8 mg/L。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，雨生紅球藻積累蝦青素（6.82±0.118）mg/L，與預(yù)測(cè)值相符，說明該擬合方程能較好地預(yù)測(cè)雨生紅球藻蝦青素的積累情況。

3 討論

雨生紅球藻受到生物或環(huán)境因素等脅迫后，鞭毛退化，由游動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)細(xì)胞，細(xì)胞壁變厚，體內(nèi)色素發(fā)生變化，誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成[15]。陶云瑩等[16]研究指出，溫度對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素有顯著影響，27℃下蝦青素積累效果最好，31℃條件下蝦青素積累效果下降，本研究得到相似的結(jié)果，雨生紅球藻蝦青素積累的最佳溫度為27℃。pH值對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)和蝦青素的積累有較大影響，pH值過高會(huì)使雨生紅球藻細(xì)胞貼壁或沉底，生長(zhǎng)速率降低，積累蝦青素[17-18]，本試驗(yàn)得到最優(yōu)pH值為9.6。李艷國等[19]通過單因素試驗(yàn)，指出NaCl可以促進(jìn)蝦青素的積累，0.4%濃度的NaCl對(duì)蝦青素積累效果最佳，蝦青素含量平均值為3.1 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻蝦青素積累的最佳NaCl濃度為1.7 g/L，蝦青素含量平均值為6.82 mg/L，推測(cè)可能是多因素交互作用引起的。有研究表明，營養(yǎng)匱乏會(huì)激發(fā)雨生紅球藻的防御機(jī)制，開始積累蝦青素，氮脅迫會(huì)促進(jìn)蝦青素的合成[20]。硝酸還原酶是硝酸鹽還原過程中的關(guān)鍵酶和限速酶，影響植物對(duì)硝態(tài)氮還原及轉(zhuǎn)化能力[21]。鎢酸鈉作為硝酸還原酶抑制劑，能夠使植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)氮限制[22]。本研究中，鎢酸鈉濃度對(duì)雨生紅球藻蝦青素的積累具有極顯著影響，最適濃度為5.2 mmol/L。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到蝦青素積累的最佳工藝條件為溫度27℃、pH9.6、NaCl濃度 1.7g/L、鎢酸鈉濃度 5.2 mmol/L，4個(gè)因素對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累影響的順序?yàn)閜H值＞溫度＞鎢酸鈉濃度＞NaCl濃度。本研究為雨生紅球藻的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。