李文欣，李海靜，張立娟，孫方達*

（1.黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163711；2.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

海參性腺作為海參精深加工過程中的副產物，其營養(yǎng)價值極高（蛋白質含量約為55%[1]，脫脂海參性腺蛋白質含量約為80%[2]），富含多種氨基酸（谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等），是優(yōu)質的動物多肽來源[3]。但因相應加工技術落后和人為認知等原因，海參性腺大多在加工海參產品后被拋棄，既造成資源浪費又引起環(huán)境污染[4]。因此，海參性腺的回收利用不僅可以有效保護環(huán)境和減少資源浪費，而且以海參性腺為原料提取的功能物質也具有極高的生物活性和利用價值。胡楊[5]和蔡彬新等[6]研究表明，海參內臟中還富含血管緊張素轉化酶（angiotensin convert enzyme，ACE）抑制肽，可作為制備抑制肽的原料。

ACE抑制肽是一類具有ACE抑制活性的多肽物質，其可以抑制ACE酶的活性，從而起到預防和治療高血壓等相關疾病的作用[7]。其中，動物性ACE抑制肽的安全性高、穩(wěn)定性好、易被人體消化吸收，成為一種具有開發(fā)潛力的材料[8]。ACE抑制肽的提取方法有：分離提取法、微生物發(fā)酵法、基因工程法和酶解法等，其中酶解法最為常用[9]。雖然酶解法具有溫和、專一性強、操作簡單、安全性高且不會對環(huán)境造成污染等優(yōu)點[10]，但其酶解時間長、效率低[11]。因此，為了提高酶解效率，可以采用其它技術相輔助，其中超聲輔助技術研究最為廣泛[12]。超聲波作用于酶解體系時可產生熱、空化以及機械效應等，提高傳質能力的同時促進底物進入酶的催化部位，使底物與酶的接觸機會增加，提高酶解速率，縮短酶解時間，獲得含量豐富的活性多肽[13]。Wang等[14]研究表明超聲波預處理可以顯著提高燕麥蛋白水解液的水解率和ACE抑制活性。李瑩等[15]利用超聲波輔助菠蘿蛋白酶制備泥鰍源ACE抑制肽，結果表明超聲波有效提高了酶解液的ACE抑制率。

因此，本文采用超聲預處理輔助中性蛋白酶水解海參性腺制備海參性腺ACE抑制肽，得出可以高效制備海參性腺ACE抑制肽的超聲預處理參數(shù)（功率、時間）和酶解條件（底物濃度、酶添加量、酶解時間），分析超濾后海參性腺ACE抑制肽的體外消化情況，從而為超聲輔助酶解制備海參性腺ACE抑制肽提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參性腺：大連水產有限公司；中性蛋白酶（酶活力為 81 137 U/g）、胃蛋白酶（酶活力為 16 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活力為11 400 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）（酶活力為2 U/mg～6 U/mg）、呋喃丙烯酰三肽 [N-（3-（2-furyl）acryloyl）-phe-gly-gly，F(xiàn)APGG]、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 {2-[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazine]ethanesulfonic acid，HEPES}：Sigma公司；所用化學試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

AL-104-精密電子天平：廣州森美特輕工機械制造有限公司；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱：蘇州歐文烘箱制造有限公司；FE20K型pH計：蘇州華宏儀表有限公司；GL-21M冷凍離心機：上海思龍科學儀器有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞粉碎機：南京吮瑪儀器設備有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：廣州儀德精密科學儀器股份有限公司；721型可見分光光度計：西安凱美克儀器設備有限公司；Millipore超濾管3、10 kDa：密理博中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 海參性腺基本物質含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》，利用直接干燥法測定水分含量[16]；參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》，利用索式抽提法測定粗脂肪含量[17]；參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》，利用灼燒稱重法測定灰分含量[18]；參照GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》，利用凱氏定氮法測定粗蛋白含量[19]；氨基酸組成分析參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[20]。

1.3.2 海參性腺脫脂

海參性腺凍干研磨成粉，過60目篩，取100 g粉加入400 mL正己烷和50 mL乙醇（8∶1，體積比）攪拌1 h，在 4℃、8 000×g離心力條件下離心 10 min，重復操作兩次。將脫脂后的海參性腺粉在室溫（25±1）℃下自然風干，然后置于-20℃條件下保存。

1.3.3 超聲預處理

用蒸餾水溶解海參性腺脫脂凍干粉，將其配制成一定濃度的溶液。研究不同超聲功率和超聲時間對海參性腺蛋白酶解特性的影響。每個因素的水平設計如下：超聲功率 100、200、300、400、500 W，超聲 15 min；超聲處理時間 5、15、25、35 min，超聲功率 200 W。其中超聲波間歇模式為超聲工作2 s和間歇2 s。

1.3.4 海參性腺酶解

將超聲預處理后的溶液調節(jié)pH值至7.0，加入中性蛋白酶（酶活力為81 137 U/g），在50℃下酶解一定時間。酶解完成后，再熱水?。?00℃）10 min使中性蛋白酶滅活，然后10 000×g離心30 min，得到上清液并檢測其ACE酶抑制活性，并將其凍干成粉在-20℃下儲存便于后面試驗使用。

因素水平考察如下：底物濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，酶解時間為2h，酶添加量為4500U/g；酶解時間 1、2、3、4、5、6 h，底物濃度為 2%，酶添加量為 4 500 U/g；酶添加量 1 500、3 000、4 500、6 000、7 500 U/g，底物濃度為2%，酶解時間為2 h。

1.3.5 水解度的測定

水解度采用pH-stat方法測定[21]，由下式計算

式中：Nb為堿液的濃度，mol/L；B為堿液的體積，mL；Mp為水解液中蛋白質質量，g；Htot為原蛋白質中總肽鍵數(shù)，海參性腺蛋白為8.2 mmol/g；h為被裂解的肽鍵數(shù)，mmol/g；1/α為校正系數(shù)，受特定pH值和溫度影響；pK為α-氨基酸的平均pK值，按7.0算。

1.3.6 ACE抑制率的測定

FAPGG作為ACE的底物，測定時具體添加組分和濃度見表1。

表1 添加組分和濃度Table 1 Add component and concentration

用酶標儀在340 nm處測定空白孔和樣品孔的初始吸光度和37℃下反應30 min后的吸光度，初始吸光度分別為A1和B1，反應后吸光度分別為A2和B2。平行測定5組。抑制率可用下式表示。

參考丁青芝[21]的方法在ACE抑制率的基礎上測定IC50。

1.3.7 水解物的分級分離

用10、3kDa的超濾管對酶解液超濾離心（10000×g，5 min），得到不同分子量（molecular weight，MW）的3個組分，組分 I：MW＞10 kDa；組分 II：3 kDa＜MW＜10 kDa；組分III：MW＜3 kDa。將得到的肽片段濾出液，一部分經真空冷凍處理后變?yōu)閮龈煞?；一部?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 體外模擬胃腸消化試驗

根據(jù)馬勇等[22]的方法對海參性腺ACE抑制肽的消化穩(wěn)定性進行評估。用4 mol/L的HCl將肽溶液的pH值調節(jié)至 2.0。加入胃蛋白酶（E/S＝16 000 U/g），然后將混合物在37℃溫育2 h。用0.9 mol/L的NaHCO3將pH值調節(jié)至5.3，并用1 mol/L的NaOH中和pH值至7.0。將試管放于沸水中10 min以終止反應。隨后將樣品在冰上冷卻至室溫（25±1）℃，并在 10 000×g、4 ℃下離心10 min。將上清液分為兩部分。一部分凍干并在分析之前儲存在-20℃。另一部分用1 mol/L的NaOH調節(jié)pH值至7.5，并在37℃下用胰蛋白酶（E/S=11 400 U/g）進一步消化2 h。然后將混合物滅活，離心并凍干以進行進一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個進行3次重復。所得數(shù)據(jù)用Excel整理，使用Statistix 8.0軟件的Tukey HSD程序進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 海參性腺基本營養(yǎng)成分和氨基酸組成分析

2.1.1 基本營養(yǎng)成分

海參性腺基本營養(yǎng)成分見表2。

表2 海參性腺基本營養(yǎng)成分Table 2 Contents of basic nutrients of sea cucumber gonads

表2顯示了干海參性腺基本成分組成：海參性腺中水分、灰分和粗脂肪含量分別為4.91%、17.63%和12.83%，而粗蛋白含量占總質量的42.86%，這表明海參性腺蛋白質含量豐富，秦洪[23]也發(fā)現(xiàn)海參內臟中蛋白質的含量較高（59.5%），遠高于一般動物源食品，因此可作為制備動物源蛋白質及相應多肽制品的原料。

2.1.2 氨基酸組成

海參性腺氨基酸組成如表3所示。

表3 海參性腺氨基酸組成分析Table 3 Amino acid composition of sea cucumber gonads

海參性腺共含有17種氨基酸，包括8種必需氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸）和9種非必需氨基酸，兩者分別占總氨基酸含量的47.17%和52.83%，必需氨基酸/非必需氨基酸值為0.89。Lee等[24]發(fā)現(xiàn)海參內臟中必需氨基酸/非必需氨基酸值（0.99～1.15）比海參體壁（0.67～0.78）的高。秦洪[23]指出必需氨基酸/非必需氨基酸值越高，蛋白的價值越高。

海參性腺還含有8種疏水性氨基酸（丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸），占總氨基酸含量39.50%。賈俊強[25]研究發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸含量與ACE抑制肽活性呈正相關，因為疏水氨基酸趨向于存在ACE抑制肽的C端，C端氨基酸對提高抑制肽的活性具有重要的作用。故海參性腺疏水性氨基酸含量高說明其適合于ACE抑制肽的制備。

2.2 超聲輔助酶解條件對海參性腺水解物水解度和ACE抑制率的影響

2.2.1 超聲預處理條件對海參性腺水解物水解度和ACE抑制率的影響

2.2.1.1 超聲功率

超聲功率對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率影響見圖1。

圖1 超聲功率對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響Fig.1 Effects of ultrasound power on DH and ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad

由圖1可知，水解度隨超聲功率的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，水解度在300 W時達到最大值8.75%（P＜0.05）。這可能是因為適度的超聲波處理可以改變底物蛋白的空間結構，增加了底物與蛋白酶的結合位點，導致海參性腺蛋白中的大量肽鍵被水解，從而使水解度升高。ACE抑制率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)相同的趨勢，ACE抑制率在超聲功率為200 W時達到最大值（73.8%），與未超聲組相比，ACE抑制率顯著提高了13.7%（P＜0.05）。李瑩等[15]得到類似的結果：適當功率（350 W）超聲波輔助酶解泥鰍可以顯著提高酶解液ACE抑制活性。這是因為超聲功率的增加導致空化效應產生的能量增加，疏松了海參性腺蛋白結構，更多酶結合位點和疏水性氨基酸基團被暴露，在酶解過程中釋放出更多的ACE抑制肽，由此獲得更高的ACE抑制率[26]。而過高功率的超聲可能會產生較強的空化效應，使蛋白質發(fā)生碰撞而折疊，從而引起蛋白質聚集，進一步導致酶解位點減少，不利于酶解。此外，毛麗等[27]認為高功率超聲產生過多的空化泡，形成聲波屏障，不利于超聲作用于全部物料。綜上，超聲功率為200 W時酶解效果最理想。

2.2.1.2 超聲時間

超聲時間對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率影響見圖2。

圖2 超聲時間對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響Fig.2 Effects of ultrasound time on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad

由圖2可知，海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率隨超聲時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，超聲15 min時，與未超聲組相比，水解度和ACE抑制率分別提高了25.9%和13.2%。Wang等[14]在超聲輔助酶解處理燕麥分離蛋白的試驗中得到了相似的結果：水解度和ACE抑制率隨超聲時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，超聲20 min時兩者均達到最大值。超聲波能夠誘導蛋白質分子展開，使蛋白質分子間的疏水相互作用被破壞，暴露更多的疏水基團和區(qū)域，導致水解度的增加，并產生更多具有ACE抑制活性的肽[28]。而較長時間的超聲處理會導致蛋白質重新卷曲、折疊，使暴露的酶位點再次包裹在蛋白質內部，不利于酶解[14]。同時，疏水基團因過長時間的超聲處理而暴露、交聯(lián)，隱藏了疏水性氨基酸，ACE抑制肽的產生被抑制[29]。

2.2.2 酶解條件對海參性腺水解物水解度和ACE抑制率的影響

2.2.2.1 底物濃度

底物濃度對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率影響見圖3。

圖3 底物濃度對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad

由圖3可知，底物濃度的增大導致水解度和ACE抑制率先增后降，水解度在底物濃度為1.0%時有最大值（P＜0.05），ACE抑制率在底物濃度為2.0%～3.0%時較高（P＜0.05）。適當?shù)牡孜餄舛瓤梢允钩暱栈a生的作用力充分的作用在蛋白顆粒上，使底物與酶的結合更有效，促進酶解反應，從而提高了酶解反應速率，導致水解度和ACE抑制率增大[25]。然而隨著底物濃度的不斷增加，增加了物料黏度，因而抑制了酶解反應的繼續(xù)進行，從而使海參性腺中活性肽釋放量減少，引起水解度和ACE抑制率下降[30]。

2.2.2.2 酶解時間

酶解時間對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis time on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad

由圖4可知，水解度隨著酶解時間的增加先逐漸增大后趨于平緩。王紫微[30]在超聲輔助酶解克氏原螯蝦的試驗中得到了類似的結果：水解度隨酶解時間的延長先上升后趨于平緩。在反應初期，蛋白酶活性較高，反應速率較快，隨著時間的延長，酶解反應達到終點，蛋白酶的活性降低，導致水解度增長緩慢[31]。ACE抑制率隨著酶解時間的增加先急劇升高后逐漸降低，ACE抑制率在酶解2 h時達到最高值73.8%（P＜0.05）。酶解初期，底物蛋白含量高、酶活性高和產物少等條件促使底物蛋白被迅速分解為多肽片段，ACE抑制肽含量增加，因此使ACE抑制率得到提高[21]。隨著酶解時間的進一步延長，降低了ACE抑制活性，這是由于過長的酶解時間會導致酶與蛋白質的過度反應，多肽進一步降解為小分子短肽或游離氨基酸，過短的肽段不具有ACE抑制活性[14]。

2.2.2.3 酶添加量

酶添加量對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響見圖5。

圖5 酶添加量對海參性腺水解物的水解度和ACE抑制率的影響Fig.5 Effects of enzyme concentration on DH and on ACE-inhibition rate of hydrolysates from sea cucumber gonad

由圖5可以看出，水解度隨著加酶量的增加（1 500 U/g～7 500 U/g）先上升后趨于平穩(wěn)。曹榮等[3]也發(fā)現(xiàn)海參性腺水解度隨中性蛋白酶添加量的增加呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢。當?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶含量增加，酶與底物結合位點增多，酶解速率加快，酶解產物中小分子肽含量增加，水解度上升[21]。當酶添加量達到6 000 U/g時，酶與底物間的接觸位點可能接近飽和，因此水解度的增加速率逐漸放緩[32]。海參性腺酶解液的ACE抑制率隨著酶的添加先升高后降低，當酶添加量為4 500 U/g時產物的ACE抑制率達到最大（73.6%）。這是因為隨著酶量的增加，海參性腺的酶解更加充分，增加了ACE抑制肽的釋放，從而使ACE抑制率升高[30]。而酶添加量過大會使海參性腺過度水解，把釋放出的ACE抑制肽水解成失活片段或變?yōu)榈突钚缘碾钠蝃25]，降低ACE抑制率。

2.3 海參性腺蛋白水解物體外胃腸模擬消化研究

2.3.1 水解物不同組分的ACE抑制率

海參性腺酶解液是由不同分子量（molecular weight，MW）的多肽組成的混合物，超濾離心后，酶解液被濃縮，從而使具有ACE抑制活性的肽的濃度增加。將上述處理條件下（超聲預處理功率200 W，超聲時間15 min，底物濃度2%，酶解時間2 h，酶添加量4 500 U/g）制備的海參性腺酶解液經超濾后按分子量分為 3 個組分：組分 I（MW＞10 kDa）、組分 II（3 kDa＜MW＜10 kDa）和組分III（MW＜3 kDa），具體見圖6。

圖6 海參性腺水解物經超濾后得到的3個不同分子量組分以及各自組分的ACE抑制活性Fig.6 ACE inhibitory activities of hydrolysates from sea cucumber gonad and its three fractions after ultrafiltration

由圖6可知，與未超濾組相比（IC50=3.97mg/mL），第III組分顯示出最高的ACE抑制活性（IC50=1.37mg/mL），第I組分具有最低的活性（IC50=6.60 mg/mL）。這說明海參性腺ACE抑制活性與肽分子量大小有關，二者呈負相關，當分子量小于3 kDa時，抑制效果最為顯著（P＜0.05）。張可佳[33]制備牡蠣ACE抑制肽后發(fā)現(xiàn)：與原酶解液和分子量大于3 kDa的組分相比，小于3 kDa的超濾液的ACE抑制活性較高。此外，Jin等[34]也發(fā)現(xiàn)肽的活性強弱與其自身的分子量大小密切相關，分子量越小，ACE抑制活性越高。

2.3.2 消化模擬

ACE抑制肽普遍為口服液，進入體內經腸道消化酶降解后會造成生物活性的改變[35]。因此體外模擬降血壓肽抗腸道酶降解是很有必要的。表4顯示了將海參性腺蛋白酶解液經超濾后得到不同分子量的組分，模擬胃消化（胃蛋白酶）和腸消化（胃蛋白酶+胰蛋白酶）后的ACE抑制活性。

表4 海參性腺水解物超濾所得的不同分子量多肽經體外消化后產物的ACE抑制活性Table 4 ACE inhibitory activities of peptides of different molecular weights obtained from ultrafiltration of sea cucumber gonad hydrolysate after intestinal digestion in vitro

通過胃消化和腸消化后，與未超濾的海參性腺酶解液相比，超濾后的肽段ACE抑制活性均顯著提高（P＜0.05），這可能是由于超濾后的多肽經消化后形成活性更高的小分子ACE抑制肽。Tagliazucchi等[36]也發(fā)現(xiàn)了菜豆酶解產物在體外胃腸模擬消化試驗中表現(xiàn)出較強的ACE抑制活性。相同肽段的海參性腺酶解液經胃蛋白酶與兩種酶共同作用后的IC50值并無顯著差異（P＞0.05），說明酶解液中部分ACE抑制肽仍具有較高活性，消化對酶解液活性無顯著影響。因此，消化前后海參性腺ACE抑制肽活性差異并不大，在體內能夠表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性并發(fā)揮其功能。

3 結論

通過測定水解度和ACE抑制率，篩選得出了制備海參性腺ACE抑制肽的最佳工藝條件：超聲預處理功率200 W，超聲時間15 min，底物濃度2%，酶解時間2 h，酶添加量4 500 U/g。超濾后肽的分子量與ACE抑制活性呈負相關，經胃消化（胃蛋白酶）、腸消化（胃蛋白酶+胰蛋白酶）后，ACE抑制肽并未降解，穩(wěn)定性較好。因此，超聲波輔助酶解法可作為制備海參性腺ACE抑制肽的有效方法。