董 浩，呂育財(cái)，任立偉，龔大春，沈聯(lián)兵

(1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所，湖北 宜昌 443002；3.宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443002)

硫酸新霉素生產(chǎn)廢水是一類有機(jī)污染物濃度高、水質(zhì)復(fù)雜、處理難度大的工業(yè)廢水，直接排放會(huì)造成非常嚴(yán)重的水體污染，尤其是廢水中殘留的硫酸新霉素及副產(chǎn)品會(huì)對(duì)環(huán)境及人體造成不可挽回的影響，亟需研發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的硫酸新霉素廢水處理技術(shù)[1-2]。目前，硫酸新霉素等抗生素類廢水的處理主要采用活性污泥A/O法[3]，該法通過硝化和反硝化作用能有效去除廢水中大量的COD和NH3-N。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，廢水處理工藝不斷改進(jìn)，對(duì)廢水活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的分析也成為研究熱點(diǎn)。彭永臻等[4]對(duì)不同地方污水處理廠不同來(lái)源的活性污泥進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，得到了活性污泥微生物群落的結(jié)構(gòu)組成及優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)據(jù)；還有研究者采用16S rDNA測(cè)序方法快速鑒定廢水處理系統(tǒng)中的目標(biāo)細(xì)菌[5]、對(duì)活性污泥胞外聚合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析[6]、通過馴化分離篩選更高效的硝化與反硝化細(xì)菌[7-10]，從而提高活性污泥A/O法對(duì)硫酸新霉素廢水中COD和NH3-N的處理效率[11-12]。但硫酸新霉素廢水活性污泥中富集了大量的好氧及厭氧微生物，這些微生物通過生長(zhǎng)代謝及相互作用形成了復(fù)雜的微生物群落[13]。因此，分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)硫酸新霉素廢水處理具有至關(guān)重要的作用。

作者以硫酸新霉素廢水處理中的好氧、厭氧活性污泥為研究對(duì)象，采用16S V3-V4擴(kuò)增區(qū)域的微生物分類測(cè)序方法，對(duì)2種活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)和差異物種進(jìn)行分析，探尋2種活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群以及硫酸新霉素廢水處理系統(tǒng)中的目標(biāo)細(xì)菌，為硫酸新霉素廢水處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

好氧活性污泥(原始樣品編號(hào)：200628)和厭氧活性污泥(原始樣品編號(hào)：200701)，從硫酸新霉素廢水處理廠采集后分別放入滅菌2 mL樣品管中，常溫保存。

土壤DNA處理工具包，OMEGA；Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒，Life；PCR反應(yīng)混合液、DNA選擇珠子，Yeasen；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Pico-21型臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher；GL-88B型漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DY-Ⅲ型電泳儀，北京六一儀器廠；FR-1000型凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；Q32866型熒光計(jì)，Invitrogen；ETC 811型 PCR擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；0.5～10 μL移液器，Eppendorf。

1.2 樣本DNA的提取

2 mL離心管中加入0.8 mL活性污泥，振蕩5 min使其混勻；加入80 μL DS緩沖液，振蕩混勻，70 ℃恒溫金屬浴裂解10 min；室溫13 000 r·min-1離心5 min；吸取600 μL上清液于新的2 mL離心管中，加入200 μL SP2緩沖液，振蕩混勻；加入100 μL HTR試劑，振蕩10 s使其混勻，冰浴5 min；室溫13 000 r·min-1離心5 min；吸取400 μL上清液于新的2 mL離心管中，加入450 μL固定緩沖液和40 μL Magsi粒子，振蕩混勻，室溫靜置2 min；置于磁力架上吸附5 min，小心吸棄上清液；加入500 μL固定緩沖液，振蕩混勻，室溫靜置2 min；小心吸棄上清液，加入1 000 μL PHB緩沖液，振蕩混勻，置于磁力架上吸附5 min，棄上清液；加入1 000 μL SPM清洗緩沖液，振蕩混勻，置于磁力架上吸附5 min，棄上清液，重復(fù)該步驟；置于55 ℃烘箱中烘10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)；加入60 μL洗脫緩沖液，充分振蕩混勻，65 ℃金屬浴10 min；置于磁力架上吸附5 min，小心吸取上清液于新的1.5 mL離心管中，即得樣本DNA。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA完整性；采用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)樣本DNA濃度，分別為120 ng·μL-1(好氧活性污泥樣本200628)、21.8 ng·μL-1(厭氧活性污泥樣本200701)。

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR引物合成和DNA測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。正向引物Nobar_341F為5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物Nobar_805R為5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。

PCR第一輪擴(kuò)增：將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min→→(94 ℃，30 s→45 ℃，20 s→65 ℃，30 s)5→→(94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s)20→→72 ℃，5 min→→10 ℃，∞。

PCR第二輪擴(kuò)增：將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，3 min→→(94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s)5→→72 ℃，5 min→→10 ℃，∞。

采用Miseq測(cè)序方法對(duì)樣本DNA進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用RDP 16S數(shù)據(jù)庫(kù)、Silva 16S數(shù)據(jù)庫(kù)及NCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧、厭氧活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)好氧活性污泥樣本200628與厭氧活性污泥樣本200701的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，門水平的相對(duì)豐度如圖1所示，屬水平的相對(duì)豐度如圖2所示。

圖1 活性污泥中的微生物門水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.1 Relative abundance histogram of microorganisms in activated sludge at phylum level

圖2 活性污泥中的微生物屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance histogram of microorganisms in activated sludge at genus level

由圖1可知，從門水平而言，好氧活性污泥中的微生物類型主要為變形菌門(Proteobacteria，34.3%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，11.5%)，2類微生物合計(jì)45.8%，變形菌門微生物的相對(duì)豐度約為擬桿菌門微生物的3倍；厭氧活性污泥中的微生物類型主要為厚壁菌門(Firmicutes，42.7%)、擬桿菌門(15.5%)和變形菌門(10.7%)，3類微生物合計(jì)68.9%。2種活性污泥均含有較多的變形菌門和擬桿菌門微生物。

由圖2可知，從屬水平而言，好氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的微生物為Parcubacteria_genera_incertae_sedis(2.9%)，但其在厭氧活性污泥中的相對(duì)豐度極低(<0.1%)，其次為硝化螺菌屬(Nitrospira，1.9%)和Aquihabitans(1.9%)；厭氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的微生物為芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)，芽孢八疊球菌屬的代表為脲芽孢八疊球菌，但該菌在硫酸新霉素廢水處理體系中未檢測(cè)到，其次為甲烷絲菌屬(Methanothrix，4.2%)、泰氏菌屬(Tissierella，3.8%)、嗜堿菌屬(Alkaliphilus，3.7%)、副球菌屬(Paracoccus，3.2%)、Pusillimonas(2.3%)、Petrimonas(2.3%)和Pelolinea(2.1%)。

2.2 好氧、厭氧活性污泥中的高豐度微生物在廢水處理過程中的代謝功能預(yù)測(cè)

為了研究硫酸新霉素廢水處理過程中的代謝產(chǎn)物與活性污泥中高豐度微生物的相關(guān)性，采用PICRUST(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)預(yù)測(cè)活性污泥樣本200628和200701中高豐度微生物在廢水處理過程中的代謝功能相對(duì)豐度，結(jié)果見表1。

表1 活性污泥中高豐度微生物的預(yù)測(cè)代謝功能相對(duì)豐度/%

由表1可知，好氧活性污泥樣本200628中相對(duì)豐度較高的3個(gè)屬(Parcubacteria_genera_incertae_sedis、Nitrospira、Aquihabitans)與硝化作用(nitrification)、有氧亞硝酸鹽氧化(aerobic nitrite oxidation)、甲基營(yíng)養(yǎng)(methylotrophy)和甲烷營(yíng)養(yǎng)(methanotrophy)等4種功能密切相關(guān)，其中硝化作用相對(duì)豐度最高(34.41%)；厭氧活性污泥樣本200701中相對(duì)豐度較高的8個(gè)屬(Sporosarcina、Methanothrix、Tissierella、Alkaliphilus、Paracoccus、Pusillimonas、Petrimonas、Pelolinea)與產(chǎn)甲烷(methanogenesis)、甲基營(yíng)養(yǎng)、甲醇氧化(methanol oxidation)、氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷化(hydrogenotrophic methanogenesis)、通過CO2和H2的還原產(chǎn)生甲烷(methanogenesis by CO2reduction with H2)、通過H2還原甲基生成甲烷(methanogenesis by reduction of methyl compounds with H2)等6種功能密切相關(guān)，其中產(chǎn)甲烷相對(duì)豐度最高(36.33%)。因此，推測(cè)好氧活性污泥中3個(gè)高豐度微生物的主要功能為硝化作用，厭氧活性污泥中8個(gè)高豐度微生物的主要功能為產(chǎn)甲烷。

2.3 好氧、厭氧活性污泥中的微生物群落主要差異物種的分析與其主體菌屬的判定

為進(jìn)一步分析好氧、厭氧活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)與廢水處理功能的關(guān)系，對(duì)2種活性污泥樣本200628、200701中的微生物群落主要差異物種分別進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，好氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的變形菌門可能存在3種變形菌屬(Alphaproteobacteriaα-變形菌，4.55%、Gammaproteobacteria丙型變形菌，7.43%、Betaproteobacteriaβ-變形菌，19.19%)，而厭氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的厚壁菌門可能存在2種厚壁菌屬(Bacilli芽孢桿菌，16.56%、Clostridia梭菌，23.71%)。

將3種變形菌屬、2種厚壁菌屬的代表操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)進(jìn)行比較，同時(shí)將各OTU的相對(duì)豐度進(jìn)行標(biāo)注，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，好氧活性污泥中丙型變形菌代表OTU34的相對(duì)豐度為2.20%、β-變形菌代表OTU195和OTU89的相對(duì)豐度分別為1.08%和1.23%；厭氧活性污泥中芽孢桿菌代表OTU4和OTU175的相對(duì)豐度分別為8.24%和1.23%、梭菌代表OTU8、OTU26和OTU16的相對(duì)豐度分別為3.03%、1.13%和1.85%。根據(jù)OTU分類學(xué)信息表，好氧活性污泥中OTU34為Xanthomonadaceae黃單胞菌屬，OTU195和OTU89均為Rhodocyclaceae紅環(huán)菌屬；厭氧活性污泥中OTU4為Planococcaceae動(dòng)性球菌屬，OTU175為Bacillus芽孢桿菌屬，OTU8為Alkaliphilus嗜堿菌屬，OTU26和OTU16均為Tissierella泰氏菌屬。上述代表OTU在好氧活性污泥中的相對(duì)豐度分別為：OTU34，2.20%、OTU195，1.08%、OTU89，1.23%、OTU4，0、OTU175，0.32%、OTU8，0.0065%、OTU26，0.0065%、OTU16，0.013%；在厭氧活性污泥中的相對(duì)豐度分別為：OTU34，0.0097%、OTU195，0、OTU89，0.19%、OTU4，8.24%、OTU175，1.23%、OTU8，3.03%、OTU26，1.13%、OTU16，1.85%。

圖4 2種活性污泥中的微生物群落分類學(xué)系統(tǒng)樹狀圖(帶有OTU標(biāo)示)Fig.4 Tree diagram of taxonomic systems of microbial community structure in two kinds of activated sludge(with OTU marking)

通過比較分析好氧活性污泥中變形菌屬及厭氧活性污泥中厚壁菌屬的代表OTU，可以得出以下結(jié)論：(1)在好氧活性污泥中，OTU4的相對(duì)豐度為0，OTU8、OTU26、OTU16的相對(duì)豐度幾乎為0，說(shuō)明未投入使用的好氧活性污泥中沒有動(dòng)性球菌，幾乎沒有嗜堿菌和泰氏菌；OTU34的相對(duì)豐度最高，說(shuō)明未投入使用的好氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的變形菌屬為黃單胞菌，其次是紅環(huán)菌；(2)在厭氧活性污泥中，OTU195的相對(duì)豐度為0，但OTU89的相對(duì)豐度卻達(dá)0.19%，說(shuō)明未投入使用的厭氧活性污泥中存在紅環(huán)菌；OTU34的相對(duì)豐度幾乎為0，說(shuō)明未投入使用的厭氧活性污泥中幾乎沒有黃單胞菌；OTU4的相對(duì)豐度最高，說(shuō)明未投入使用的厭氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的厚壁菌屬為動(dòng)性球菌，其次相對(duì)豐度由高到低分別為嗜堿菌和泰氏菌；(3)2種活性污泥中OTU89、OTU175均有一定的相對(duì)豐度值，說(shuō)明2種未投入使用的活性污泥中均存在一定數(shù)量紅環(huán)菌和芽孢桿菌。

3 結(jié)論

(1)采用宏基因組技術(shù)對(duì)好氧、厭氧活性污泥進(jìn)行微生物分類測(cè)序，發(fā)現(xiàn)活性污泥中的微生物群落組成超過20個(gè)屬(不包括未分類的屬)，能滿足硫酸新霉素廢水處理的性能要求。

(2)從門水平分析來(lái)看，變形菌門和擬桿菌門是好氧活性污泥中的主體菌門，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是厭氧活性污泥中的主體菌門，活性污泥中都含有較多的變形菌門和擬桿菌門；從屬水平分析來(lái)看，未投入使用的好氧活性污泥中高豐度菌屬的排序?yàn)椋篜arcubacteria_genera_incertae_sedis>硝化螺菌屬(Nitrospira，大致與Aquihabitans相當(dāng))，而未投入使用的厭氧活性污泥中高豐度菌屬的排序?yàn)椋貉挎甙睡B球菌屬(Sporosarcina)>甲烷絲菌屬(Methanothrix)>泰氏菌屬(Tissierella)>嗜堿菌屬(Alkaliphius)>副球菌屬(Paracoccus)>Pusillimonas(大致與Petrimonas相當(dāng))>Pelolinea。

(3)結(jié)合高豐度微生物代謝功能預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)，推測(cè)好氧活性污泥中高豐度微生物的主要功能為硝化作用，厭氧活性污泥中高豐度微生物的主要功能為產(chǎn)甲烷；通過2種活性污泥微生物群落的主要差異物種的分析，發(fā)現(xiàn)好氧活性污泥中變形菌門可能存在3種變形菌屬，分別是α-變形菌、丙型變形菌、β-變形菌，而厭氧活性污泥中厚壁菌門可能存在2種厚壁菌屬，分別是芽孢桿菌、梭菌；對(duì)其中的主體菌屬進(jìn)行判定，好氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的變形菌屬為黃單胞菌，而厭氧活性污泥中相對(duì)豐度最高的厚壁菌屬為動(dòng)性球菌。

(4)該研究發(fā)現(xiàn)的活性污泥優(yōu)勢(shì)菌群，將對(duì)硫酸新霉素廢水處理系統(tǒng)中的目標(biāo)細(xì)菌調(diào)控具有重要指導(dǎo)意義，也將為優(yōu)化活性污泥A/O法處理硫酸新霉素廢水的工藝提供重要的參考數(shù)據(jù)。