任明婧，陶德江，程 雷，梁 杉，王成濤

(北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048)

靛藍(lán)是一種重要的顏料，廣泛用于食品生產(chǎn)[1]。但天然靛藍(lán)色素相對稀少，來源有限，主要是通過化學(xué)合成制造[2]，而化學(xué)合成靛藍(lán)色素由于原料和中間產(chǎn)物會(huì)對環(huán)境造成污染[3-4]。因此，靛藍(lán)的生物合成受到了廣泛的關(guān)注。

在實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)PseudomonasputidaB3中靛藍(lán)生物合成關(guān)鍵酶基因styAB上游存在一個(gè)二元調(diào)控系統(tǒng)StyS-StyR。將styAB基因進(jìn)行誘導(dǎo)型表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與二元調(diào)控系統(tǒng)StyS-StyR的調(diào)控密切相關(guān)[5]。表1展示了styS和styR基因及其表達(dá)的蛋白質(zhì)序列與其他報(bào)道的styS和styR基因的差異比較。表1表明，苯乙烯降解基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因序列是保守的，并且與甲苯降解細(xì)菌中常見的todS和todT二元調(diào)控系統(tǒng)具有高度同源性[6]。

表1 Pseudomonas putida B3 中styS和styR基因及其產(chǎn)物與其他已知來源菌種對比Tab.1 Comparison of Pseudomonas putida B3 styS and styR genes and their products with other known bacteria

由于表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相似性，styS和styR基因可能以二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)的形式調(diào)節(jié)整個(gè)苯乙烯降解基因簇的轉(zhuǎn)錄，類似于經(jīng)典的二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)todS和todT[7]。StyS激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域外部的感應(yīng)外部刺激的區(qū)域引發(fā)，從而導(dǎo)致自磷酸化，然后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至下游調(diào)節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基，磷酸化的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白與DNA或其他調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的配體結(jié)合[8-12]。

但激酶蛋白StyS的自磷酸化的位點(diǎn)和傳導(dǎo)機(jī)制尚未探明，此磷酸信號傳導(dǎo)過程對靛藍(lán)色素生物代謝途徑的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其作用機(jī)理尚不明確，這可能限制了這種重要的天然色素的深入開發(fā)和應(yīng)用[13]。

本研究以具備合成靛藍(lán)色素能力的PseudomonasputidaB3為研究對象，解析StyS自磷酸化對靛藍(lán)合成的影響，以確認(rèn)其磷酸化位點(diǎn)在相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PseudomonasputidaB3、P.putidaB3-ΔstyS、P.putidaB3-ΔstyS-0，實(shí)驗(yàn)室保存；pBBR1MCS-2，武漢淼靈生物有限公司；Escherichia coli DH5α，北京天根生化科技有限公司；靛藍(lán)(色譜純)、吲哚(分析純)，考馬斯亮藍(lán)、卡那霉素、N,N-二甲基甲酰胺，LB肉湯培養(yǎng)基，北京半夏生物科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)DNA聚合酶、6×蛋白質(zhì)Maker、核酸限制性內(nèi)切酶、10000DL DNA Marker、Supercoiled DNA Ladder Maker、T4 DNA 連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒等試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和多功能 DNA 純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；離心管，美國BioRad公司；Ziptip C18萃取柱，美國Milipore公司；Kinase-GloTM激酶測定試劑盒，美國Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 Touch型PCR儀、PowerPac Basic型電泳儀(水平電泳槽)，美國BIO-RAD公司;3K15型高速離心機(jī)，美國Sigma公司;SPX-150B型生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;LC-20AT型高效液相色譜，日本Shimadzu公司;BioLector?Ⅰ型微生物反應(yīng)器，德國M2P Labs公司；BioSpectrum 凝膠成像儀，美國 UVP 公司；小型高速離心機(jī)，美國Sigma公司；渦旋振蕩器，德國 IKA 公司；超凈工作臺(tái)、水浴搖床、空氣浴搖床，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSA224S型數(shù)字電子天平，Sartorius公司；移液器，Eppendorf 公司；SpectraMaxi3型連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵

將PseudomonasputidaB3單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中[13]，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，此時(shí)培養(yǎng)物的OD600值約為0.6，然后將新鮮培養(yǎng)物以1%的接種量接種到苯乙烯終濃度為10 mg/L的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基[5]中，發(fā)酵12 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[14]。

1.3.2蛋白質(zhì)提取

收集發(fā)酵液并以12 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將細(xì)胞重懸于3 mL裂解緩沖液中。隨后，將重懸的細(xì)菌放置在冰上進(jìn)行超聲破碎，用25 kHz、500 W超聲處理10 min，超聲條件為工作5 s，間歇5 s。最后，將細(xì)菌裂解液以12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液用于檢測[13,15]。

1.3.3StyS激酶蛋白磷酸化位點(diǎn)鑒定

激酶蛋白StyS的磷酸化修飾鑒定由北京青蓮百奧生物科技有限公司完成[16]。

1.3.4styS基因擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取PseudomonasputidaB3基因組DNA?；趤碜云渌?xì)菌的同源基因序列，使用引物對styS-F(5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′)和styS-R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)，從PseudomonasputidaB3中擴(kuò)增了styS基因。利用純化回收試劑盒分離擴(kuò)增的基因并進(jìn)行凝膠純化。隨后，用QuickCutBamHI和HindIII限制酶在37 ℃將styS基因和pBBR1MCS-2質(zhì)粒雙酶切30 min。

酶切后，將基因片段與載體片段連接，并將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性轉(zhuǎn)化體，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證無誤后，使用預(yù)冷的電擊杯，電極間隙為2 mm，將成功驗(yàn)證的質(zhì)粒電擊入PseudomonasputidaB3-ΔstyS中。電擊轉(zhuǎn)化條件為1.5 kV，400 Ω和25 μF[5,17]。

1.3.5激酶StyS磷酸化位點(diǎn)突變及質(zhì)粒構(gòu)建

磷酸化位點(diǎn)的定點(diǎn)誘變(蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?由北京華大基因研究中心提供支持。成功突變后，將基因突變序列連接到pBBR1MCS-2質(zhì)粒中。

1.3.6野生型及突變體生長曲線測定

使用BioLector?Ⅰ型微生物反應(yīng)器實(shí)時(shí)監(jiān)測在LB培養(yǎng)基中的種子液體生長曲線。由于菌株在發(fā)酵液中產(chǎn)生靛藍(lán)色素，會(huì)對細(xì)菌生長不同周期的吸光值產(chǎn)生影響，因此選擇細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中細(xì)菌的生長情況[17]。

1.3.7靛藍(lán)產(chǎn)量測定

將每個(gè)菌株的單個(gè)菌落接種入液體LB肉湯培養(yǎng)基中(由于質(zhì)粒pBBR1MCS-2帶有卡那霉素抗性，因此必要時(shí)添加0.1 mmol/L卡那霉素)，在200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)12 h后，以體積比為1%的接種量接種入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以10 000 r/min離心20 min，棄去上清液。加入20 mLN，N-二甲基甲酰胺，超聲30 min，將提取液通過0.22 μm過濾器過濾。使用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.8 μm)通過高效液相色譜分析靛藍(lán)含量。檢測條件V(水)∶V(甲醇)=70∶30混合物用作流動(dòng)相、0.2 mL/min的流速，檢測波長610 nm[14]，重復(fù)測定3次取平均值。

1.3.8激酶活性檢測

使用Kinase-GloTM激酶測定試劑盒測定StyS激酶活性。取10 μg目的蛋白，加入35 μL反應(yīng)緩沖液和5 μL終濃度5 μmol/L的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸、adenosine triphosphate)。該反應(yīng)在37 ℃下進(jìn)行10 min，然后添加50 μL發(fā)光劑，在37 ℃下繼續(xù)反應(yīng)10 min。最后，使用酶標(biāo)儀在560 nm的波長處測量發(fā)光值[18-19]，重復(fù)測定3次取平均值。

1.3.9驗(yàn)證定點(diǎn)突變體中的磷酸化修飾

為了確定突變蛋白是否被磷酸化，如1.3.3節(jié)所述，通過質(zhì)譜分析突變蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 StyS蛋白及StyS突變蛋白磷酸化位點(diǎn)鑒定

磷酸化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的一種共價(jià)修飾形式，同時(shí)也是最重要的調(diào)控修飾形式。蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾后不僅影響蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，還影響其亞細(xì)胞地位以及與其他物質(zhì)之間的相互作用，從而改變蛋白質(zhì)的活性和功能。激酶蛋白發(fā)生磷酸化修飾的過程是感應(yīng)外界刺激后結(jié)合ATP,發(fā)生自磷酸化，然后將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到下游蛋白質(zhì)特定的結(jié)合位點(diǎn)的過程[20-21]。結(jié)合國內(nèi)外部分研究結(jié)果及激酶蛋白StyS的結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，StyS蛋白在感應(yīng)外界刺激后可發(fā)生自磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)styR基因的表達(dá)及StyR蛋白的磷酸化[6]，因此我們將在發(fā)酵條件下提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，明確肽段并獲得其第二個(gè)片段離子的分子質(zhì)量。然后，根據(jù)獲得的肽段序列和蛋白質(zhì)信息，推測在苯乙烯誘導(dǎo)培養(yǎng)后提取得到的StyS蛋白結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為蘇氨酸和天冬氨酸(圖1)。

為了進(jìn)一步明確磷酸化位點(diǎn)對靛藍(lán)生物合成的影響，如1.3.5節(jié)所述，本研究將582位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?ACC-GCC)，將679位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?GAT-GAA)，并且對突變蛋白進(jìn)行了磷酸化質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)突變蛋白未發(fā)生磷酸化，因而沒有檢測到磷酸化結(jié)合位點(diǎn)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，前期預(yù)測的582位蘇氨酸和679位天冬氨酸確為該蛋白的磷酸化位點(diǎn)。這一結(jié)果有助于開展進(jìn)一步研究，闡釋StyS蛋白的自磷酸化對靛藍(lán)生物合成的影響。

*：t代表發(fā)生磷酸化修飾的蘇氨酸位點(diǎn)，d代表發(fā)生磷酸化修飾的天冬氨酸位點(diǎn)，T代表蘇氨酸(Thr)，H代表組氨酸(His)，N代表天冬酰胺(Asn)，A代表丙氨酸(Ala)，D代表天冬氨酸(Asp)，L代表亮氨酸(Leu)，V代表纈氨酸(Val)，Q代表谷氨酰胺(Gln)，R代表精氨酸(Arg)，G代表甘氨酸(Gly)。圖1 激酶蛋白質(zhì)譜分析鑒定磷酸化位點(diǎn)Fig.1 Identification of phosphorylation sites based on mass spectrometry analysis of kinase protein

2.2 重組質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

以PseudomonasputidaB3基因組作為模板，PCR擴(kuò)增得到2 952 bp的styS基因，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳見圖2。經(jīng)測序，克隆產(chǎn)物基因序列與GenBank中的styS基因序列一致，說明成功得到styS序列。進(jìn)而將擴(kuò)增產(chǎn)物通過HindIII和BamHI酶切后插入到表達(dá)載體pBBR1MCS-2中，構(gòu)建得到8 105 bp的styS基因過表達(dá)重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS，該重組質(zhì)粒及其雙酶切電泳見圖3。進(jìn)一步，利用同源重組的方法構(gòu)建582位的蘇氨酸和679位的天冬氨酸磷酸化位點(diǎn)突變質(zhì)粒，并將突變后的序列插入到pBBR1MCS-2質(zhì)粒中，構(gòu)建8 099 bp的磷酸化位點(diǎn)突變質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1。由圖3(b)可知，pBBR1MCS-2-styS-1經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切后，可得大小約為5 144 bp和2 960 bp的2個(gè)條帶，分別與載體pBBR1MCS-2和突變styS基因大小一致。最后，將pBBR1MCS-2-styS，pBBR1MCS-2-styS-1和空載體(pBBR1MCS-2)分別轉(zhuǎn)化到styS基因缺失菌株P(guān)seudomonasputidaB3-ΔstyS中，成功構(gòu)建styS基因回補(bǔ)菌株B3-ΔstyS-8、磷酸化位點(diǎn)突變菌株 B3-ΔstyS-1和對照菌株B3-ΔstyS-0。

M為DL10000 DNA Marker；泳道1為styS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 styS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of styS gene PCR product

M為DL12,000 DNA Marker；泳道1為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS；泳道2為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS雙酶切產(chǎn)物;泳道3為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1雙酶切產(chǎn)物；泳道4為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1。圖3 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證電泳Fig.3 Electrophoresis of double restriction enzyme digestion products of recombinant plasmid

為確保在靛藍(lán)發(fā)酵過程中觀察到的表型變化并非因?yàn)槭艿骄w生長差異的影響，對每個(gè)菌株在不同階段的生長速率進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖4。從圖4可看出，對照菌和突變菌株種子液的生長情況與野生菌株P(guān)seudomonasputidaB3基本一致，無顯著差異，可知載體的轉(zhuǎn)化及基因的突變對菌體在種子液中的生長未見明顯的影響。

圖4 LB培養(yǎng)基中野生菌和突變菌株生長曲線Fig.4 Growth curves of wild-type and mutant strains in Luria-Bertani medium

在此基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞平板計(jì)數(shù)的方法測定了發(fā)酵液中各菌株的生長曲線，結(jié)果見圖5。各菌株前期增值迅速，快速進(jìn)入對數(shù)期，在發(fā)酵液中發(fā)酵12 h后各菌株進(jìn)入穩(wěn)定期。同時(shí)，各菌株處于穩(wěn)定時(shí)期的時(shí)間較短，是因?yàn)榈刺荚捶N類單一且濃度低，其生長曲線與種子液生長曲線一致，各菌株的生長情況無明顯差異。該結(jié)果亦說明在靛藍(lán)發(fā)酵體系中，styS基因的缺失和磷酸化位點(diǎn)的突變不會(huì)顯著影響細(xì)胞生長，也不會(huì)殺死細(xì)胞或降低其生長速率。因此，各菌株在發(fā)酵系統(tǒng)中的表型變化差異可能是由于代謝途徑中的相關(guān)變化所引起，與載體的轉(zhuǎn)化和磷酸化位點(diǎn)的突變無關(guān)。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基中野生菌株和突變菌株生長曲線Fig.5 Growth curves of wild-type and mutant strains in fermentation medium

2.3 激酶蛋白StyS自磷酸化對靛藍(lán)產(chǎn)量的影響

為明確磷酸化位點(diǎn)對靛藍(lán)生物合成的影響，首先將菌株B3，B3-ΔstyS，B3-ΔstyS-0，B3-ΔstyS-1和B3-ΔstyS-8接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中并培養(yǎng)48 h，靛藍(lán)產(chǎn)量測定結(jié)果見圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵48 h后，菌株B3和菌株B3-ΔstyS-8均產(chǎn)生了靛藍(lán)。野生型B3菌株的靛藍(lán)產(chǎn)率為10.14 mg/L，而B3-ΔstyS-8菌株的靛藍(lán)產(chǎn)率為3.63 mg/L。相反，菌株B3-ΔstyS，B3-ΔstyS-0和B3-ΔstyS-1在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生靛藍(lán)。

圖6 野生型及突變菌株的靛藍(lán)產(chǎn)量分析Fig.6 Analysis of indigo production of wild type and mutant strains

因此可知，在PseudomonasputidaB3中styS基因的缺失和磷酸化位點(diǎn)的突變均使突變菌株喪失了合成靛藍(lán)色素的能力。styS基因作為靛藍(lán)色素生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控因子，是靛藍(lán)色素合成調(diào)節(jié)基因磷酸信號傳導(dǎo)的起點(diǎn)，亦是整個(gè)靛藍(lán)色素生物合成的開始，其磷酸化在整個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用，其基因功能的缺失會(huì)造成合成酶基因表達(dá)的停止，進(jìn)而影響突變菌株合成靛藍(lán)色素的能力。進(jìn)而可知激酶蛋白StyS磷酸化位點(diǎn)的突變使其無法進(jìn)行自身磷酸化，阻斷了整個(gè)磷酸化信號傳導(dǎo)過程。因此，激酶蛋白StyS上的磷酸化位點(diǎn)通過調(diào)節(jié)自磷酸化作用參與整個(gè)靛藍(lán)生物合成途徑，磷酸化位點(diǎn)的突變會(huì)影響靛藍(lán)的產(chǎn)生，其在PseudomonasputidaB3靛藍(lán)生物合成途徑中起重要調(diào)控作用。

2.4 激酶酶活水平分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化位點(diǎn)突變對靛藍(lán)產(chǎn)生的影響可能是由于激酶活性的喪失，我們研究了磷酸化位點(diǎn)突變對PseudomonasputidaB3中激酶活性的影響。發(fā)酵12 h后，從細(xì)菌細(xì)胞裂解物中提取蛋白質(zhì)，并測定了該蛋白激酶活性。以PseudomonasputidaB3的激酶活性為基礎(chǔ)，對比各菌株中激酶酶活水平發(fā)現(xiàn)，在缺失styS基因的B3-ΔstyS和B3-ΔstyS-0菌株中均未檢測到激酶活性，見圖7。同時(shí)，在缺少styS基因并帶有表達(dá)StyS磷酸化位點(diǎn)突變載體的B3-ΔstyS-1菌株中也未檢測到激酶活性。相反，由于styS基因可通過pBBR1MCS-2-styS載體表達(dá)，styS基因回補(bǔ)菌株B3-ΔstyS-8具有激酶活性，但其活性顯著低于野生菌株B3。研究結(jié)果表明，突變磷酸化位點(diǎn)在PseudomonasputidaB3中改變了StyS蛋白的激酶活性，磷酸化位點(diǎn)的突變使激酶蛋白StyS喪失了酶活，使其無法自磷酸化，也無法將磷酸基團(tuán)傳遞給調(diào)節(jié)蛋白，進(jìn)而使調(diào)節(jié)蛋白無法與下游靛藍(lán)合成關(guān)鍵基因styAB的啟動(dòng)子結(jié)合。StyS激酶活性的喪失可能導(dǎo)致PseudomonasputidaB3中產(chǎn)生靛藍(lán)的關(guān)鍵基因styAB表達(dá)的失敗，最終影響了靛藍(lán)的產(chǎn)生，控制了靛藍(lán)生物合成代謝途徑。

圖7 野生型及突變菌株的StyS激酶蛋白活性分析Fig.7 Analysis of StyS kinase protein activity in wild-type and mutant strains

3 結(jié) 論

StyS-StyR作為一種重要的二元調(diào)控系統(tǒng)，對靛藍(lán)生物合成過程發(fā)揮著重要作用。但是激酶蛋白StyS磷酸化位點(diǎn)不明，其自磷酸化機(jī)制仍未研究清楚。為了確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)中所檢測到的磷酸化位點(diǎn)是否對靛藍(lán)生物合成的代謝調(diào)控具有作用，本研究利用同源重組方法成功構(gòu)建得到磷酸化位點(diǎn)突變質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入styS基因缺失菌株中成功構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變菌株。對野生株、回補(bǔ)菌株、styS基因缺失菌株、磷酸化位點(diǎn)突變株和陰性對照菌株之間的靛藍(lán)產(chǎn)量和激酶活性差異的比較分析表明，野生菌株和styS基因回補(bǔ)菌株具有合成靛藍(lán)的能力，而styS基因缺失菌株和磷酸化位點(diǎn)突變株均喪失了產(chǎn)生靛藍(lán)的能力。

研究結(jié)果說明，磷酸化位點(diǎn)的突變使激酶蛋白StyS失活并阻止其進(jìn)行自身磷酸化。由于磷酸基團(tuán)在靛藍(lán)生物合成調(diào)控系統(tǒng)中的傳遞受阻，使得下游調(diào)節(jié)蛋白無法與靛藍(lán)合成關(guān)鍵基因styAB的啟動(dòng)子結(jié)合，無法啟動(dòng)下游相關(guān)基因的表達(dá)，從而使菌株喪失了生物合成靛藍(lán)色素的能力?？梢?，磷酸化位點(diǎn)在靛藍(lán)生物合成途徑中的作用是通過影響整個(gè)磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來控制關(guān)鍵基因styAB的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)整個(gè)靛藍(lán)生物合成代謝途徑。激酶蛋白StyS中的磷酸結(jié)合位點(diǎn)在整個(gè)靛藍(lán)合成途徑中起著重要的作用，其與下游的調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用以及下游蛋白磷酸化后的功能變化還待進(jìn)一步研究，希望此結(jié)果可為今后的靛藍(lán)色素生物合成研究提供新的思路。