任明婧，陶德江，程 雷，梁 杉，王成濤

(北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048)

靛藍是一種重要的顏料，廣泛用于食品生產(chǎn)[1]。但天然靛藍色素相對稀少，來源有限，主要是通過化學合成制造[2]，而化學合成靛藍色素由于原料和中間產(chǎn)物會對環(huán)境造成污染[3-4]。因此，靛藍的生物合成受到了廣泛的關(guān)注。

在實驗室前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)PseudomonasputidaB3中靛藍生物合成關(guān)鍵酶基因styAB上游存在一個二元調(diào)控系統(tǒng)StyS-StyR。將styAB基因進行誘導型表達后發(fā)現(xiàn)，其表達水平與二元調(diào)控系統(tǒng)StyS-StyR的調(diào)控密切相關(guān)[5]。表1展示了styS和styR基因及其表達的蛋白質(zhì)序列與其他報道的styS和styR基因的差異比較。表1表明，苯乙烯降解基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因序列是保守的，并且與甲苯降解細菌中常見的todS和todT二元調(diào)控系統(tǒng)具有高度同源性[6]。

表1 Pseudomonas putida B3 中styS和styR基因及其產(chǎn)物與其他已知來源菌種對比Tab.1 Comparison of Pseudomonas putida B3 styS and styR genes and their products with other known bacteria

由于表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相似性，styS和styR基因可能以二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)的形式調(diào)節(jié)整個苯乙烯降解基因簇的轉(zhuǎn)錄，類似于經(jīng)典的二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)todS和todT[7]。StyS激酶的信號轉(zhuǎn)導由組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域外部的感應(yīng)外部刺激的區(qū)域引發(fā)，從而導致自磷酸化，然后將磷酸基團轉(zhuǎn)移至下游調(diào)節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基，磷酸化的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白與DNA或其他調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達的配體結(jié)合[8-12]。

但激酶蛋白StyS的自磷酸化的位點和傳導機制尚未探明，此磷酸信號傳導過程對靛藍色素生物代謝途徑的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其作用機理尚不明確，這可能限制了這種重要的天然色素的深入開發(fā)和應(yīng)用[13]。

本研究以具備合成靛藍色素能力的PseudomonasputidaB3為研究對象，解析StyS自磷酸化對靛藍合成的影響，以確認其磷酸化位點在相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PseudomonasputidaB3、P.putidaB3-ΔstyS、P.putidaB3-ΔstyS-0，實驗室保存；pBBR1MCS-2，武漢淼靈生物有限公司；Escherichia coli DH5α，北京天根生化科技有限公司；靛藍(色譜純)、吲哚(分析純)，考馬斯亮藍、卡那霉素、N,N-二甲基甲酰胺，LB肉湯培養(yǎng)基，北京半夏生物科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)DNA聚合酶、6×蛋白質(zhì)Maker、核酸限制性內(nèi)切酶、10000DL DNA Marker、Supercoiled DNA Ladder Maker、T4 DNA 連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒等試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和多功能 DNA 純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；離心管，美國BioRad公司；Ziptip C18萃取柱，美國Milipore公司；Kinase-GloTM激酶測定試劑盒，美國Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 Touch型PCR儀、PowerPac Basic型電泳儀(水平電泳槽)，美國BIO-RAD公司;3K15型高速離心機，美國Sigma公司;SPX-150B型生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;LC-20AT型高效液相色譜，日本Shimadzu公司;BioLector?Ⅰ型微生物反應(yīng)器，德國M2P Labs公司；BioSpectrum 凝膠成像儀，美國 UVP 公司；小型高速離心機，美國Sigma公司；渦旋振蕩器，德國 IKA 公司；超凈工作臺、水浴搖床、空氣浴搖床，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSA224S型數(shù)字電子天平，Sartorius公司；移液器，Eppendorf 公司；SpectraMaxi3型連續(xù)波長多功能酶標儀，美國MD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵

將PseudomonasputidaB3單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中[13]，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，此時培養(yǎng)物的OD600值約為0.6，然后將新鮮培養(yǎng)物以1%的接種量接種到苯乙烯終濃度為10 mg/L的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基[5]中，發(fā)酵12 h后進行后續(xù)實驗[14]。

1.3.2蛋白質(zhì)提取

收集發(fā)酵液并以12 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將細胞重懸于3 mL裂解緩沖液中。隨后，將重懸的細菌放置在冰上進行超聲破碎，用25 kHz、500 W超聲處理10 min，超聲條件為工作5 s，間歇5 s。最后，將細菌裂解液以12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液用于檢測[13,15]。

1.3.3StyS激酶蛋白磷酸化位點鑒定

激酶蛋白StyS的磷酸化修飾鑒定由北京青蓮百奧生物科技有限公司完成[16]。

1.3.4styS基因擴增及質(zhì)粒構(gòu)建

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取PseudomonasputidaB3基因組DNA?；趤碜云渌毦耐椿蛐蛄?，使用引物對styS-F(5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′)和styS-R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)，從PseudomonasputidaB3中擴增了styS基因。利用純化回收試劑盒分離擴增的基因并進行凝膠純化。隨后，用QuickCutBamHI和HindIII限制酶在37 ℃將styS基因和pBBR1MCS-2質(zhì)粒雙酶切30 min。

酶切后，將基因片段與載體片段連接，并將重組載體導入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，選擇陽性轉(zhuǎn)化體，提取重組質(zhì)粒進行驗證。驗證無誤后，使用預(yù)冷的電擊杯，電極間隙為2 mm，將成功驗證的質(zhì)粒電擊入PseudomonasputidaB3-ΔstyS中。電擊轉(zhuǎn)化條件為1.5 kV，400 Ω和25 μF[5,17]。

1.3.5激酶StyS磷酸化位點突變及質(zhì)粒構(gòu)建

磷酸化位點的定點誘變(蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?由北京華大基因研究中心提供支持。成功突變后，將基因突變序列連接到pBBR1MCS-2質(zhì)粒中。

1.3.6野生型及突變體生長曲線測定

使用BioLector?Ⅰ型微生物反應(yīng)器實時監(jiān)測在LB培養(yǎng)基中的種子液體生長曲線。由于菌株在發(fā)酵液中產(chǎn)生靛藍色素，會對細菌生長不同周期的吸光值產(chǎn)生影響，因此選擇細胞平板計數(shù)法測定發(fā)酵液中細菌的生長情況[17]。

1.3.7靛藍產(chǎn)量測定

將每個菌株的單個菌落接種入液體LB肉湯培養(yǎng)基中(由于質(zhì)粒pBBR1MCS-2帶有卡那霉素抗性，因此必要時添加0.1 mmol/L卡那霉素)，在200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)12 h后，以體積比為1%的接種量接種入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以10 000 r/min離心20 min，棄去上清液。加入20 mLN，N-二甲基甲酰胺，超聲30 min，將提取液通過0.22 μm過濾器過濾。使用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.8 μm)通過高效液相色譜分析靛藍含量。檢測條件V(水)∶V(甲醇)=70∶30混合物用作流動相、0.2 mL/min的流速，檢測波長610 nm[14]，重復測定3次取平均值。

1.3.8激酶活性檢測

使用Kinase-GloTM激酶測定試劑盒測定StyS激酶活性。取10 μg目的蛋白，加入35 μL反應(yīng)緩沖液和5 μL終濃度5 μmol/L的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸、adenosine triphosphate)。該反應(yīng)在37 ℃下進行10 min，然后添加50 μL發(fā)光劑，在37 ℃下繼續(xù)反應(yīng)10 min。最后，使用酶標儀在560 nm的波長處測量發(fā)光值[18-19]，重復測定3次取平均值。

1.3.9驗證定點突變體中的磷酸化修飾

為了確定突變蛋白是否被磷酸化，如1.3.3節(jié)所述，通過質(zhì)譜分析突變蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 StyS蛋白及StyS突變蛋白磷酸化位點鑒定

磷酸化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的一種共價修飾形式，同時也是最重要的調(diào)控修飾形式。蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾后不僅影響蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)，還影響其亞細胞地位以及與其他物質(zhì)之間的相互作用，從而改變蛋白質(zhì)的活性和功能。激酶蛋白發(fā)生磷酸化修飾的過程是感應(yīng)外界刺激后結(jié)合ATP,發(fā)生自磷酸化，然后將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到下游蛋白質(zhì)特定的結(jié)合位點的過程[20-21]。結(jié)合國內(nèi)外部分研究結(jié)果及激酶蛋白StyS的結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，StyS蛋白在感應(yīng)外界刺激后可發(fā)生自磷酸化，進而促進styR基因的表達及StyR蛋白的磷酸化[6]，因此我們將在發(fā)酵條件下提取的蛋白質(zhì)樣品進行質(zhì)譜分析，明確肽段并獲得其第二個片段離子的分子質(zhì)量。然后，根據(jù)獲得的肽段序列和蛋白質(zhì)信息，推測在苯乙烯誘導培養(yǎng)后提取得到的StyS蛋白結(jié)構(gòu)中存在兩個磷酸化位點，分別為蘇氨酸和天冬氨酸(圖1)。

為了進一步明確磷酸化位點對靛藍生物合成的影響，如1.3.5節(jié)所述，本研究將582位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?ACC-GCC)，將679位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?GAT-GAA)，并且對突變蛋白進行了磷酸化質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)突變蛋白未發(fā)生磷酸化，因而沒有檢測到磷酸化結(jié)合位點。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，前期預(yù)測的582位蘇氨酸和679位天冬氨酸確為該蛋白的磷酸化位點。這一結(jié)果有助于開展進一步研究，闡釋StyS蛋白的自磷酸化對靛藍生物合成的影響。

*：t代表發(fā)生磷酸化修飾的蘇氨酸位點，d代表發(fā)生磷酸化修飾的天冬氨酸位點，T代表蘇氨酸(Thr)，H代表組氨酸(His)，N代表天冬酰胺(Asn)，A代表丙氨酸(Ala)，D代表天冬氨酸(Asp)，L代表亮氨酸(Leu)，V代表纈氨酸(Val)，Q代表谷氨酰胺(Gln)，R代表精氨酸(Arg)，G代表甘氨酸(Gly)。圖1 激酶蛋白質(zhì)譜分析鑒定磷酸化位點Fig.1 Identification of phosphorylation sites based on mass spectrometry analysis of kinase protein

2.2 重組質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

以PseudomonasputidaB3基因組作為模板，PCR擴增得到2 952 bp的styS基因，擴增產(chǎn)物凝膠電泳見圖2。經(jīng)測序，克隆產(chǎn)物基因序列與GenBank中的styS基因序列一致，說明成功得到styS序列。進而將擴增產(chǎn)物通過HindIII和BamHI酶切后插入到表達載體pBBR1MCS-2中，構(gòu)建得到8 105 bp的styS基因過表達重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS，該重組質(zhì)粒及其雙酶切電泳見圖3。進一步，利用同源重組的方法構(gòu)建582位的蘇氨酸和679位的天冬氨酸磷酸化位點突變質(zhì)粒，并將突變后的序列插入到pBBR1MCS-2質(zhì)粒中，構(gòu)建8 099 bp的磷酸化位點突變質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1。由圖3(b)可知，pBBR1MCS-2-styS-1經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切后，可得大小約為5 144 bp和2 960 bp的2個條帶，分別與載體pBBR1MCS-2和突變styS基因大小一致。最后，將pBBR1MCS-2-styS，pBBR1MCS-2-styS-1和空載體(pBBR1MCS-2)分別轉(zhuǎn)化到styS基因缺失菌株P(guān)seudomonasputidaB3-ΔstyS中，成功構(gòu)建styS基因回補菌株B3-ΔstyS-8、磷酸化位點突變菌株 B3-ΔstyS-1和對照菌株B3-ΔstyS-0。

M為DL10000 DNA Marker；泳道1為styS基因PCR擴增產(chǎn)物。圖2 styS基因PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of styS gene PCR product

M為DL12,000 DNA Marker；泳道1為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS；泳道2為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS雙酶切產(chǎn)物;泳道3為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1雙酶切產(chǎn)物；泳道4為重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-styS-1。圖3 重組質(zhì)粒的酶切驗證電泳Fig.3 Electrophoresis of double restriction enzyme digestion products of recombinant plasmid

為確保在靛藍發(fā)酵過程中觀察到的表型變化并非因為受到菌體生長差異的影響，對每個菌株在不同階段的生長速率進行了測定，結(jié)果見圖4。從圖4可看出，對照菌和突變菌株種子液的生長情況與野生菌株P(guān)seudomonasputidaB3基本一致，無顯著差異，可知載體的轉(zhuǎn)化及基因的突變對菌體在種子液中的生長未見明顯的影響。

圖4 LB培養(yǎng)基中野生菌和突變菌株生長曲線Fig.4 Growth curves of wild-type and mutant strains in Luria-Bertani medium

在此基礎(chǔ)上，通過細胞平板計數(shù)的方法測定了發(fā)酵液中各菌株的生長曲線，結(jié)果見圖5。各菌株前期增值迅速，快速進入對數(shù)期，在發(fā)酵液中發(fā)酵12 h后各菌株進入穩(wěn)定期。同時，各菌株處于穩(wěn)定時期的時間較短，是因為氮源碳源種類單一且濃度低，其生長曲線與種子液生長曲線一致，各菌株的生長情況無明顯差異。該結(jié)果亦說明在靛藍發(fā)酵體系中，styS基因的缺失和磷酸化位點的突變不會顯著影響細胞生長，也不會殺死細胞或降低其生長速率。因此，各菌株在發(fā)酵系統(tǒng)中的表型變化差異可能是由于代謝途徑中的相關(guān)變化所引起，與載體的轉(zhuǎn)化和磷酸化位點的突變無關(guān)。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基中野生菌株和突變菌株生長曲線Fig.5 Growth curves of wild-type and mutant strains in fermentation medium

2.3 激酶蛋白StyS自磷酸化對靛藍產(chǎn)量的影響

為明確磷酸化位點對靛藍生物合成的影響，首先將菌株B3，B3-ΔstyS，B3-ΔstyS-0，B3-ΔstyS-1和B3-ΔstyS-8接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中并培養(yǎng)48 h，靛藍產(chǎn)量測定結(jié)果見圖6。實驗結(jié)果表明，發(fā)酵48 h后，菌株B3和菌株B3-ΔstyS-8均產(chǎn)生了靛藍。野生型B3菌株的靛藍產(chǎn)率為10.14 mg/L，而B3-ΔstyS-8菌株的靛藍產(chǎn)率為3.63 mg/L。相反，菌株B3-ΔstyS，B3-ΔstyS-0和B3-ΔstyS-1在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生靛藍。

圖6 野生型及突變菌株的靛藍產(chǎn)量分析Fig.6 Analysis of indigo production of wild type and mutant strains

因此可知，在PseudomonasputidaB3中styS基因的缺失和磷酸化位點的突變均使突變菌株喪失了合成靛藍色素的能力。styS基因作為靛藍色素生物合成關(guān)鍵酶基因的表達調(diào)控因子，是靛藍色素合成調(diào)節(jié)基因磷酸信號傳導的起點，亦是整個靛藍色素生物合成的開始，其磷酸化在整個信號轉(zhuǎn)導過程中起著重要作用，其基因功能的缺失會造成合成酶基因表達的停止，進而影響突變菌株合成靛藍色素的能力。進而可知激酶蛋白StyS磷酸化位點的突變使其無法進行自身磷酸化，阻斷了整個磷酸化信號傳導過程。因此，激酶蛋白StyS上的磷酸化位點通過調(diào)節(jié)自磷酸化作用參與整個靛藍生物合成途徑，磷酸化位點的突變會影響靛藍的產(chǎn)生，其在PseudomonasputidaB3靛藍生物合成途徑中起重要調(diào)控作用。

2.4 激酶酶活水平分析

為進一步驗證磷酸化位點突變對靛藍產(chǎn)生的影響可能是由于激酶活性的喪失，我們研究了磷酸化位點突變對PseudomonasputidaB3中激酶活性的影響。發(fā)酵12 h后，從細菌細胞裂解物中提取蛋白質(zhì)，并測定了該蛋白激酶活性。以PseudomonasputidaB3的激酶活性為基礎(chǔ)，對比各菌株中激酶酶活水平發(fā)現(xiàn)，在缺失styS基因的B3-ΔstyS和B3-ΔstyS-0菌株中均未檢測到激酶活性，見圖7。同時，在缺少styS基因并帶有表達StyS磷酸化位點突變載體的B3-ΔstyS-1菌株中也未檢測到激酶活性。相反，由于styS基因可通過pBBR1MCS-2-styS載體表達，styS基因回補菌株B3-ΔstyS-8具有激酶活性，但其活性顯著低于野生菌株B3。研究結(jié)果表明，突變磷酸化位點在PseudomonasputidaB3中改變了StyS蛋白的激酶活性，磷酸化位點的突變使激酶蛋白StyS喪失了酶活，使其無法自磷酸化，也無法將磷酸基團傳遞給調(diào)節(jié)蛋白，進而使調(diào)節(jié)蛋白無法與下游靛藍合成關(guān)鍵基因styAB的啟動子結(jié)合。StyS激酶活性的喪失可能導致PseudomonasputidaB3中產(chǎn)生靛藍的關(guān)鍵基因styAB表達的失敗，最終影響了靛藍的產(chǎn)生，控制了靛藍生物合成代謝途徑。

圖7 野生型及突變菌株的StyS激酶蛋白活性分析Fig.7 Analysis of StyS kinase protein activity in wild-type and mutant strains

3 結(jié) 論

StyS-StyR作為一種重要的二元調(diào)控系統(tǒng)，對靛藍生物合成過程發(fā)揮著重要作用。但是激酶蛋白StyS磷酸化位點不明，其自磷酸化機制仍未研究清楚。為了確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)中所檢測到的磷酸化位點是否對靛藍生物合成的代謝調(diào)控具有作用，本研究利用同源重組方法成功構(gòu)建得到磷酸化位點突變質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入styS基因缺失菌株中成功構(gòu)建磷酸化位點突變菌株。對野生株、回補菌株、styS基因缺失菌株、磷酸化位點突變株和陰性對照菌株之間的靛藍產(chǎn)量和激酶活性差異的比較分析表明，野生菌株和styS基因回補菌株具有合成靛藍的能力，而styS基因缺失菌株和磷酸化位點突變株均喪失了產(chǎn)生靛藍的能力。

研究結(jié)果說明，磷酸化位點的突變使激酶蛋白StyS失活并阻止其進行自身磷酸化。由于磷酸基團在靛藍生物合成調(diào)控系統(tǒng)中的傳遞受阻，使得下游調(diào)節(jié)蛋白無法與靛藍合成關(guān)鍵基因styAB的啟動子結(jié)合，無法啟動下游相關(guān)基因的表達，從而使菌株喪失了生物合成靛藍色素的能力?？梢?，磷酸化位點在靛藍生物合成途徑中的作用是通過影響整個磷酸化信號轉(zhuǎn)導過程來控制關(guān)鍵基因styAB的表達，從而調(diào)節(jié)整個靛藍生物合成代謝途徑。激酶蛋白StyS中的磷酸結(jié)合位點在整個靛藍合成途徑中起著重要的作用，其與下游的調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用以及下游蛋白磷酸化后的功能變化還待進一步研究，希望此結(jié)果可為今后的靛藍色素生物合成研究提供新的思路。