趙林芬,弘子姍,楊 凱,龔加順,譚 超
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)
咖啡豆(coffee bean)是茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)植物的種子[1]。作為一種古老的天然飲品,咖啡具有多種活性成分,烘焙后散發(fā)誘人的芳香[2-3]。云南是中國(guó)第一個(gè)種植咖啡的省份,也是目前我國(guó)最大的咖啡產(chǎn)地,主要種植小??Х?CoffeaarabicaLinn.)。種植區(qū)主要分布在云南西南部的保山、臨滄、普洱、版納、怒江等地,那里大部分海拔超過1 000 m[4]。得天獨(dú)厚的自然條件,海拔和緯度造就了云南咖啡酸味適中、濃而不苦、香味醇和、略帶果味的特質(zhì)[5],但與瑰夏(Geisha)等精品咖啡相比,云南咖啡豆花果甜香風(fēng)味不足??Х蕊L(fēng)味不僅受品種和種植環(huán)境的影響,采收后加工過程中發(fā)酵環(huán)節(jié)也起到至關(guān)重要的作用[6]。
國(guó)內(nèi)外主要聚焦于咖啡風(fēng)味成分分析及烘焙對(duì)風(fēng)味的影響研究,針對(duì)咖啡發(fā)酵風(fēng)味的研究相對(duì)不多。近年來,微生物發(fā)酵對(duì)咖啡風(fēng)味品質(zhì)形成的影響研究逐漸成為熱點(diǎn)。佟世生等[7]對(duì)酶解偶聯(lián)發(fā)酵處理的云南小粒咖啡鮮果和生豆進(jìn)行電子舌分析,發(fā)現(xiàn)通過酶解偶聯(lián)發(fā)酵咖啡鮮果可以得到與天然麝香貓咖啡風(fēng)味相同的咖啡豆。Wang等[8]通過添加葡萄糖控制乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.cremoris)發(fā)酵生咖啡豆,發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌亞種可顯著提高咖啡的風(fēng)味屬性。魏敏等[9]研究了桑腸桿菌(EnterobactermoriL4-3,CCTCC M2012020)發(fā)酵對(duì)咖啡提取物揮發(fā)性成分的影響,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后咖啡提取物中帶有咖啡特征香氣的同時(shí)還帶有濃郁堅(jiān)果、奶香等豐富香氣,刺激性成分、苦澀感減少。這些研究均是利用微生物在咖啡本身風(fēng)味特質(zhì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改善研究,通過外添天然的風(fēng)味物質(zhì)利用微生物發(fā)酵過程改善咖啡風(fēng)味品質(zhì)的研究報(bào)道較少。
釀酒酵母又稱面包酵母或出芽酵母,適宜生長(zhǎng)溫度為25~30 ℃,在低溫條件下非酒精發(fā)酵時(shí),會(huì)抗性生長(zhǎng),累積包括揮發(fā)性醇、酯、酚、酮、芳香族等豐富的香氣成分[10]。本研究擬在云南咖啡鮮果中添加可能提供香料氣味(肉桂、香草)、水果氣味(蘋果、甜橙、香蕉)、甜香氣味(蜂蜜)的底物,利用釀酒酵母發(fā)酵混合物,對(duì)發(fā)酵后的咖啡生豆進(jìn)行理化性質(zhì)、香氣成分分析,以及對(duì)烘焙后的咖啡風(fēng)味進(jìn)行主觀評(píng)價(jià)。探索混合發(fā)酵對(duì)咖啡花果甜香風(fēng)味的改善,為進(jìn)一步改善云南咖啡花果甜香特質(zhì),提升咖啡風(fēng)味提供一定理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
咖啡鮮果(CoffeaarabicaLinn.,2018年云南省普洱市苡榕莊園產(chǎn));釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,2018年安琪酵母股份有限公司產(chǎn));白砂糖,太古糖業(yè)(中國(guó))有限公司;百花蜂蜜,云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所;蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草,市售;其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。
EU-K1-20T型超純水機(jī),南京歐鎧環(huán)境科技有限公司;TGC20M型離心機(jī),湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;KDN-04B型凱氏定氮儀,浙江托普儀器有限公司;SOX406型索氏抽提儀,濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司;METTLER TOLEDO HS153型水分測(cè)定儀,上海銳析儀器設(shè)備有限公司;Brewista型200 mL專業(yè)咖啡杯測(cè)碗勺,蘇州順和豐家電科技有限公司;R500F型咖啡烘焙機(jī),北京三豆客科技有限公司;SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;FlavourSpec?型氣相離子遷移色譜儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司。
1.3.1咖啡鮮果的發(fā)酵
咖啡鮮果用超純水清洗浸泡3 min后經(jīng)121 ℃滅菌15 min。白砂糖、蜂蜜、蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草原料經(jīng)紫外照射滅菌30 min。滅菌后的咖啡鮮果和風(fēng)味底物放入超凈工作臺(tái)中備用。樣品設(shè)置為A~F共6個(gè)組,3個(gè)平行,每種樣品按m(咖啡鮮果)∶m(釀酒酵母)∶m(風(fēng)味底物)=60 g∶3 g∶37 g配制,風(fēng)味底物按每個(gè)樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比,包括對(duì)照組A為水37%;香料組B為肉桂粉1.5%、香草粉1.5%、水34%;蘋果組C為蘋果18%、糖2.4%、水16.6%;甜橙組D為甜橙18%、糖2.4%、水16.6%;香蕉組E為香蕉18%、糖2.4%、水16.6%;蜂蜜組F為蜂蜜6%、水31%。配制好的樣品裝入滅菌后的蒸煮袋,并真空封裝。于20 ℃恒溫發(fā)酵24 h后隔袋手工揉捻讓咖啡豆與果皮分離,再繼續(xù)20 ℃恒溫發(fā)酵24 h,取出分離咖啡豆于不銹鋼托盤中40 ℃鼓風(fēng)干燥至豆體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%~12%。
1.3.2咖啡生豆的烘焙
根據(jù)中度烘焙豆在香氣和口感上的相對(duì)優(yōu)勢(shì),采用中度烘焙[11]。準(zhǔn)確稱取100 g咖啡豆,置于咖啡烘焙機(jī)中烘焙,入豆溫度150 ℃,并以5 ℃/min升溫,12 min后溫度達(dá)到210 ℃后恒溫烘焙,當(dāng)咖啡豆烘焙時(shí)產(chǎn)生第一次爆破音后10 s迅速出豆冷卻,烘焙咖啡豆艾格壯數(shù)值(Agtron number)為58±1,研磨粉艾格壯數(shù)值為63±1,裝入帶單向透氣閥的袋子放置24 h。
1.3.3烘焙咖啡豆風(fēng)味的感觀評(píng)價(jià)方法
咖啡風(fēng)味的主觀評(píng)價(jià),也稱為咖啡杯測(cè),是采用美國(guó)精品咖啡協(xié)會(huì)(Specialty Coffee Association of America,SCAA)所設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn),利用人的嗅、味、觸覺來評(píng)價(jià)咖啡的品質(zhì)。本研究參考SCAA評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12],每個(gè)樣品5次重復(fù)。將烘焙后咖啡豆磨粉后過美標(biāo)20目網(wǎng)篩,取過篩后的咖啡粉(11±0.25)g加入200 mL 93 ℃的超純水靜置3 min后開始評(píng)定。評(píng)定指標(biāo)包括干/濕香氣、風(fēng)味、余韻、酸質(zhì)、體脂感、一致性、平衡性、干凈度、甜度等級(jí)、綜合考慮10項(xiàng),最終扣除瑕疵度分值,得到最終分?jǐn)?shù)。杯測(cè)表從6分開始標(biāo)注,一共分為4個(gè)級(jí)別,6分為“好”;7分為“非常好”;8分為“優(yōu)秀”;9分為“超凡”。每個(gè)等級(jí)又分4個(gè)給分等級(jí),給分單位是0.25分,4個(gè)等級(jí)共16個(gè)給分點(diǎn)。最終得分高于80分,即為精品級(jí)。
1.3.4混合發(fā)酵后咖啡生豆的理化性質(zhì)測(cè)定
總灰分的測(cè)定按GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》方法;水分含量的測(cè)定采用METTLER TOLEDO HS153型快速水分測(cè)定儀;還原糖含量的測(cè)定按GB 5009.7—2016《食品安 全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》直接滴定法;多糖含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[13-14];脂肪含量按GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中 脂肪的測(cè)定》索式抽提法;蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白 質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法??扇苄缘鞍踪|(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[15];多酚含量參考GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分:茶多酚》的方法。
1.3.5揮發(fā)性成分的測(cè)定
氣相色譜條件:1 g樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,40 ℃平衡20 min,取頂空氣體進(jìn)樣200 μL用GC-IMS進(jìn)行測(cè)試,載氣N2,進(jìn)樣針溫度45 ℃,色譜柱FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm,1 μm),柱溫箱溫度60 ℃,載氣流速程序?yàn)?~2 min,2 mL/min;2~10 min,2~15 mL/min;10~20 min,20~80 mL/min;20~40 min,100~130 mL/min。離子遷移譜條件:漂移管長(zhǎng)度98 mm;管內(nèi)線性電壓500 V/cm;漂移管溫度45 ℃;漂移氣N2;漂移氣流速150 mL/min;離子源β-射線(氚);離子化模式為正離子。
采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,采用IBM SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析,采用Laboratory Analytical Viewer和GC×IMS Library Search Software分析樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的差異譜圖,并結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對(duì)物質(zhì)初步定性。
將發(fā)酵完畢的咖啡生豆樣品A~F組進(jìn)行理化分析,結(jié)果見表1。
表1 混合發(fā)酵后的咖啡生豆基本理化成分Tab.1 Basic chemical components of coffee beans after mixed fermentation g/100 g
對(duì)6組發(fā)酵完畢的咖啡生豆進(jìn)行理化分析表明,添加不同風(fēng)味底物的咖啡生豆B~F組中脂肪和灰分的含量與對(duì)照組A均無顯著差異(P>0.05),但咖啡生豆可溶性蛋白質(zhì)含量比對(duì)照組A均顯著增加(P<0.05),增加的可溶性蛋白質(zhì)可能來源于添加的風(fēng)味底物,因?yàn)獒劸平湍咐锰妓衔镞M(jìn)行生長(zhǎng)代謝,合成可溶性蛋白質(zhì)的能力較弱。香料組B的還原糖、總蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)含量是所有組中最高的,分別為(8.28±0.39)、(6.34±0.32)、(1.87±0.01)g/100 g,其中還原糖在蘋果組C、甜橙組D中差異顯著(P<0.05),總蛋白質(zhì)在甜橙組D、香蕉組E中差異顯著(P<0.05)。有研究表明,發(fā)酵后的香草還原糖可達(dá)14.58%,肉桂中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約11.70%[16],這可能是導(dǎo)致香料組B還原糖、總蛋白質(zhì)最高的原因之一。蘋果組C添加了2.4%蔗糖,發(fā)酵過程中糖會(huì)轉(zhuǎn)化為酸類,同時(shí)蘋果本身含有大量酸類物質(zhì),因此蘋果組C的總酸含量在所有組中最高為(7.99±0.49)g/kg與香蕉組E差異顯著(P<0.05),但與其他組差異不明顯。添加了蔗糖的蘋果組C、甜橙組D、香蕉組E,還原糖的變化情況與對(duì)照組A相比參差不齊,排除一定程度上的統(tǒng)計(jì)誤差,可認(rèn)為外來糖源的添加會(huì)對(duì)咖啡豆還原糖含量造成一定影響,其中蘋果組C、甜橙組D與對(duì)照組A相比還原糖含量顯著下降(P<0.05)。利用蜂蜜無氧發(fā)酵后,蜂蜜品質(zhì)會(huì)降低,酸度增加,總糖和蔗糖含量下降[17]。蜂蜜組F酸度、多糖、還原糖含量與對(duì)照組A相比有變化,但變化不明顯(P>0.05),多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為(3.16±0.09)g/100 g與對(duì)照組A、蘋果組C、甜橙組D差異顯著(P<0.05),將其烘焙后進(jìn)行風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)其酸味過重。
從理化分析結(jié)果來看,添加不同底物與咖啡發(fā)酵對(duì)咖啡豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05),但可顯著提高可溶性蛋白質(zhì)的含量(P<0.05),而風(fēng)味底物的添加對(duì)最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質(zhì)、多酚具有不同的影響,表現(xiàn)為有的增加有的減少,有些顯著有些不顯著,變化無明顯規(guī)律,可能是受到添加風(fēng)味底物本身的影響。
利用GC-IMS對(duì)發(fā)酵后的咖啡生豆香氣進(jìn)行測(cè)試,在所有樣品中共檢出包括未知成分在內(nèi)的53種化合物,結(jié)合GC-IMS自帶譜庫及NIST譜庫共定性出36種共有化合物,分別為9種酯類、6種酮類、8種醛類、6種醇類、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類以及檢出17 個(gè)共有信號(hào)的未知成分(圖1)。通過計(jì)算相對(duì)含量(圖2),所有咖啡生豆中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質(zhì)的60%以上,這4大類成分含量和豐富度也較高。添加不同的底物進(jìn)行發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致咖啡生豆中酮、醛、醇類(除蜂蜜組F外)含量均下降,酯類、烯萜、呋喃(除香料組B外)含量上升。
圖1 混合發(fā)酵后的咖啡生豆揮發(fā)性香氣相對(duì)含量熱圖Fig.1 Heat map of relative contents of volatile aroma in coffee beans after mixed fermentation
圖2 混合發(fā)酵咖啡生豆香氣成分相對(duì)含量匯總Fig.2 Summary of relative contents of aroma components of coffee beans after mixed fermentation
在A~F組發(fā)酵后的咖啡生豆香氣中,丙酮相對(duì)含量最高為12.6%~18.6%,在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后丙酮(辛辣、微甜、愉悅香氣、帶特征性芳香)、甲基異丁酮(香蕉、水果甜、愉悅香氣)、2-丁酮含量均有不同程度下降,其他酮類化合物有增有減。
生豆醛類物質(zhì)中以壬醛(果味、脂肪、玫瑰香)、己醛(果味、木質(zhì)味、蘋果味、草味、橙子味)、2-甲基丁醛(可可味、咖啡味、果味甜)為主各占4.25%~4.75%、3.55%~5.96%、1.51%~5.72%。在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后己醛、2-甲基丁醛、丁醛(發(fā)霉、雜味、發(fā)酵刺激味)、3-甲基丁醛(蘋果味、脂肪、杏仁味)、戊醛均有不同程度下降,其他醛類化合物有增有減。
生豆醇類物質(zhì)中以乙醇(愉悅的酒精味)、異丙醇(尖銳、不愉快的燃燒味)為主,各占6.02%~7.13%、2.73%~3.18%,在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后乙醇、正戊醇、正己醇均有不同程度下降,3-甲基-3-丁烯-1-醇(水果香、草本、木質(zhì)、甜美)有不同程度上升,其他醇類化合物的相對(duì)含量有增有減。
生豆中酯類物質(zhì)最為豐富,以乙酸乙酯(香蕉、蘋果味、白葡萄、果香、甜美)、異戊酸乙酯(果味、酒味、甜味、發(fā)酵乳味)、乙酸丙酯(梨、覆盆子味、愉悅的苦甜)為主,各占2.81%~10.79%、1.05%~6.59%、1.52%~2.22%。在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后乙酸乙酯、異戊酸乙酯大幅度上升,丁酸乙酯不同程度上升,乙酸丁酯(果味、菠蘿味)、乙酸丙酯、己酸乙酯(果味、菠蘿味、香蕉味、煙味)下降,其他酯類化合物的相對(duì)含量有增有減。在酯類化合物中E組添加了香蕉的發(fā)酵咖啡酯類含量增加最為明顯,這與香蕉本身所帶有的酯類香氣物質(zhì)存在較大關(guān)系。大量增加的乙酸乙酯和異戊酸乙酯能為咖啡香氣增加獨(dú)特的果香,與此同時(shí)E組酮類中丙酮、醛類中己醛、庚醛(果味、不愉快的脂肪味)、丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛下降最明顯,這在烘焙咖啡豆風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)中也得以體現(xiàn)。
烯萜具有香料香味,月桂烯(甜美、香酯、玫瑰、芹菜、胡蘿卜、薄荷、柑橘、熱帶水果味)、檸檬烯(甜橙、柑桔味)分別有類似肉桂和檸檬清淡的香氣,生豆中烯萜類中香料組B添加了肉桂和香草的咖啡苯乙烯大幅度增加318.52%,甜橙組D添加了甜橙的咖啡檸檬烯大幅增加501.72%。香料組B、甜橙組D在最終烘焙后風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)中也能夠表現(xiàn)出相應(yīng)桂皮、香草、橙香。
香料、水果與咖啡發(fā)酵可以使得香料、水果本身所帶有的香氣賦予咖啡,提升咖啡花果香特質(zhì),蜂蜜與咖啡發(fā)酵在香氣方面未發(fā)現(xiàn)有突出特點(diǎn),不同香料、水果對(duì)咖啡果香味提升有不同針對(duì),因此如需特定提升某種花果香味尚需進(jìn)行進(jìn)一步的配比調(diào)和研究。
對(duì)混合發(fā)酵后的烘焙咖啡豆風(fēng)味進(jìn)行感觀評(píng)價(jià),得分見表2。香料組B和甜橙組D達(dá)到精品咖啡標(biāo)準(zhǔn),得分超過80分,風(fēng)味描述上可明顯辨識(shí)出精品咖啡中所希望呈現(xiàn)出的桂皮、香草、甜橙等加分風(fēng)味。B~E組評(píng)分均高于對(duì)照組A,說明添加香料及水果在低溫厭氧條件下利用釀酒酵母發(fā)酵咖啡鮮果對(duì)最終的烘焙咖啡豆風(fēng)味有一定提升。但蜂蜜組F酸度過高,風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)分低于對(duì)照組A,主要與釀酒酵母利用蜂蜜中糖類發(fā)酵產(chǎn)酸有關(guān)。烘焙咖啡豆風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)結(jié)果中所有樣品均存在酸度偏高、風(fēng)味單一、苦味突出且醇厚度低的問題。這與釀酒酵母發(fā)酵糖類產(chǎn)酸有關(guān),苦味主要來源于咖啡中綠原酸和咖啡因的變化。在利用釀酒酵母發(fā)酵咖啡增香的同時(shí),如何抑制咖啡酸苦味的增加需進(jìn)一步研究。
表2 混合發(fā)酵后的烘焙咖啡豆風(fēng)味感觀評(píng)分Tab.2 Sensory score of flavor of roasted coffee beans after mixed fermentation
利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下添加天然風(fēng)味底物與咖啡發(fā)酵,與無底物對(duì)照組相比發(fā)酵后的咖啡生豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05),可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著提高(P<0.05),而底物的添加對(duì)最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質(zhì)、多酚具有不同程度的影響,無明顯規(guī)律。對(duì)發(fā)酵后的咖啡生豆進(jìn)行GC-IMS香氣分析,共定性出 36種共有化合物,9種酯、6種酮、8種醛、6種醇、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類及17個(gè)共有未知信號(hào)成分。其中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質(zhì)的60%以上。對(duì)發(fā)酵后烘焙咖啡豆風(fēng)味進(jìn)行主觀評(píng)價(jià),表明香料、水果與咖啡發(fā)酵可使其香氣賦予咖啡,提升咖啡花果香特質(zhì),其中香料組、甜橙組風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)達(dá)精品咖啡標(biāo)準(zhǔn),香蕉組香氣較為突出。蜂蜜組在香氣方面未有突出特點(diǎn),酸度較高、甜度不足。綜合理化、香氣成分和風(fēng)味主觀評(píng)價(jià)結(jié)果來看,添加天然風(fēng)味底物并利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下發(fā)酵云南咖啡鮮果,能在一定程度上改善咖啡風(fēng)味品質(zhì)。