趙林芬，弘子姍，楊 凱，龔加順，譚 超

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

咖啡豆(coffee bean)是茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)植物的種子[1]。作為一種古老的天然飲品，咖啡具有多種活性成分，烘焙后散發(fā)誘人的芳香[2-3]。云南是中國第一個種植咖啡的省份，也是目前我國最大的咖啡產(chǎn)地，主要種植小?？Х?CoffeaarabicaLinn.)。種植區(qū)主要分布在云南西南部的保山、臨滄、普洱、版納、怒江等地，那里大部分海拔超過1 000 m[4]。得天獨(dú)厚的自然條件，海拔和緯度造就了云南咖啡酸味適中、濃而不苦、香味醇和、略帶果味的特質(zhì)[5]，但與瑰夏(Geisha)等精品咖啡相比，云南咖啡豆花果甜香風(fēng)味不足。咖啡風(fēng)味不僅受品種和種植環(huán)境的影響，采收后加工過程中發(fā)酵環(huán)節(jié)也起到至關(guān)重要的作用[6]。

國內(nèi)外主要聚焦于咖啡風(fēng)味成分分析及烘焙對風(fēng)味的影響研究，針對咖啡發(fā)酵風(fēng)味的研究相對不多。近年來，微生物發(fā)酵對咖啡風(fēng)味品質(zhì)形成的影響研究逐漸成為熱點(diǎn)。佟世生等[7]對酶解偶聯(lián)發(fā)酵處理的云南小?？Х弱r果和生豆進(jìn)行電子舌分析，發(fā)現(xiàn)通過酶解偶聯(lián)發(fā)酵咖啡鮮果可以得到與天然麝香貓咖啡風(fēng)味相同的咖啡豆。Wang等[8]通過添加葡萄糖控制乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.cremoris)發(fā)酵生咖啡豆，發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌亞種可顯著提高咖啡的風(fēng)味屬性。魏敏等[9]研究了桑腸桿菌(EnterobactermoriL4-3，CCTCC M2012020)發(fā)酵對咖啡提取物揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后咖啡提取物中帶有咖啡特征香氣的同時還帶有濃郁堅果、奶香等豐富香氣，刺激性成分、苦澀感減少。這些研究均是利用微生物在咖啡本身風(fēng)味特質(zhì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改善研究，通過外添天然的風(fēng)味物質(zhì)利用微生物發(fā)酵過程改善咖啡風(fēng)味品質(zhì)的研究報道較少。

釀酒酵母又稱面包酵母或出芽酵母，適宜生長溫度為25～30 ℃，在低溫條件下非酒精發(fā)酵時，會抗性生長，累積包括揮發(fā)性醇、酯、酚、酮、芳香族等豐富的香氣成分[10]。本研究擬在云南咖啡鮮果中添加可能提供香料氣味(肉桂、香草)、水果氣味(蘋果、甜橙、香蕉)、甜香氣味(蜂蜜)的底物，利用釀酒酵母發(fā)酵混合物，對發(fā)酵后的咖啡生豆進(jìn)行理化性質(zhì)、香氣成分分析，以及對烘焙后的咖啡風(fēng)味進(jìn)行主觀評價。探索混合發(fā)酵對咖啡花果甜香風(fēng)味的改善，為進(jìn)一步改善云南咖啡花果甜香特質(zhì)，提升咖啡風(fēng)味提供一定理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

咖啡鮮果(CoffeaarabicaLinn.，2018年云南省普洱市苡榕莊園產(chǎn))；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，2018年安琪酵母股份有限公司產(chǎn))；白砂糖，太古糖業(yè)(中國)有限公司；百花蜂蜜，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所；蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草，市售；其他實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EU-K1-20T型超純水機(jī)，南京歐鎧環(huán)境科技有限公司；TGC20M型離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；KDN-04B型凱氏定氮儀，浙江托普儀器有限公司；SOX406型索氏抽提儀，濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；METTLER TOLEDO HS153型水分測定儀，上海銳析儀器設(shè)備有限公司；Brewista型200 mL專業(yè)咖啡杯測碗勺，蘇州順和豐家電科技有限公司；R500F型咖啡烘焙機(jī)，北京三豆客科技有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；FlavourSpec?型氣相離子遷移色譜儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1咖啡鮮果的發(fā)酵

咖啡鮮果用超純水清洗浸泡3 min后經(jīng)121 ℃滅菌15 min。白砂糖、蜂蜜、蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草原料經(jīng)紫外照射滅菌30 min。滅菌后的咖啡鮮果和風(fēng)味底物放入超凈工作臺中備用。樣品設(shè)置為A～F共6個組，3個平行，每種樣品按m(咖啡鮮果)∶m(釀酒酵母)∶m(風(fēng)味底物)=60 g∶3 g∶37 g配制，風(fēng)味底物按每個樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比，包括對照組A為水37%；香料組B為肉桂粉1.5%、香草粉1.5%、水34%；蘋果組C為蘋果18%、糖2.4%、水16.6%；甜橙組D為甜橙18%、糖2.4%、水16.6%；香蕉組E為香蕉18%、糖2.4%、水16.6%；蜂蜜組F為蜂蜜6%、水31%。配制好的樣品裝入滅菌后的蒸煮袋，并真空封裝。于20 ℃恒溫發(fā)酵24 h后隔袋手工揉捻讓咖啡豆與果皮分離，再繼續(xù)20 ℃恒溫發(fā)酵24 h，取出分離咖啡豆于不銹鋼托盤中40 ℃鼓風(fēng)干燥至豆體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～12%。

1.3.2咖啡生豆的烘焙

根據(jù)中度烘焙豆在香氣和口感上的相對優(yōu)勢，采用中度烘焙[11]。準(zhǔn)確稱取100 g咖啡豆，置于咖啡烘焙機(jī)中烘焙，入豆溫度150 ℃，并以5 ℃/min升溫，12 min后溫度達(dá)到210 ℃后恒溫烘焙，當(dāng)咖啡豆烘焙時產(chǎn)生第一次爆破音后10 s迅速出豆冷卻，烘焙咖啡豆艾格壯數(shù)值(Agtron number)為58±1，研磨粉艾格壯數(shù)值為63±1，裝入帶單向透氣閥的袋子放置24 h。

1.3.3烘焙咖啡豆風(fēng)味的感觀評價方法

咖啡風(fēng)味的主觀評價，也稱為咖啡杯測，是采用美國精品咖啡協(xié)會(Specialty Coffee Association of America,SCAA)所設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)，利用人的嗅、味、觸覺來評價咖啡的品質(zhì)。本研究參考SCAA評分標(biāo)準(zhǔn)[12]，每個樣品5次重復(fù)。將烘焙后咖啡豆磨粉后過美標(biāo)20目網(wǎng)篩，取過篩后的咖啡粉(11±0.25)g加入200 mL 93 ℃的超純水靜置3 min后開始評定。評定指標(biāo)包括干/濕香氣、風(fēng)味、余韻、酸質(zhì)、體脂感、一致性、平衡性、干凈度、甜度等級、綜合考慮10項，最終扣除瑕疵度分值，得到最終分?jǐn)?shù)。杯測表從6分開始標(biāo)注，一共分為4個級別，6分為“好”；7分為“非常好”；8分為“優(yōu)秀”；9分為“超凡”。每個等級又分4個給分等級，給分單位是0.25分，4個等級共16個給分點(diǎn)。最終得分高于80分，即為精品級。

1.3.4混合發(fā)酵后咖啡生豆的理化性質(zhì)測定

總灰分的測定按GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》方法；水分含量的測定采用METTLER TOLEDO HS153型快速水分測定儀；還原糖含量的測定按GB 5009.7—2016《食品安 全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》直接滴定法；多糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法[13-14]；脂肪含量按GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中 脂肪的測定》索式抽提法；蛋白質(zhì)含量的測定按GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白 質(zhì)的測定》凱氏定氮法?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[15]；多酚含量參考GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》的方法。

1.3.5揮發(fā)性成分的測定

氣相色譜條件：1 g樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，40 ℃平衡20 min，取頂空氣體進(jìn)樣200 μL用GC-IMS進(jìn)行測試，載氣N2，進(jìn)樣針溫度45 ℃，色譜柱FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm，1 μm)，柱溫箱溫度60 ℃，載氣流速程序為0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，20～80 mL/min；20～40 min，100～130 mL/min。離子遷移譜條件：漂移管長度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣N2；漂移氣流速150 mL/min；離子源β-射線(氚)；離子化模式為正離子。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，采用Laboratory Analytical Viewer和GC×IMS Library Search Software分析樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的差異譜圖，并結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)初步定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合發(fā)酵咖啡生豆理化性質(zhì)分析

將發(fā)酵完畢的咖啡生豆樣品A～F組進(jìn)行理化分析，結(jié)果見表1。

表1 混合發(fā)酵后的咖啡生豆基本理化成分Tab.1 Basic chemical components of coffee beans after mixed fermentation g/100 g

對6組發(fā)酵完畢的咖啡生豆進(jìn)行理化分析表明，添加不同風(fēng)味底物的咖啡生豆B～F組中脂肪和灰分的含量與對照組A均無顯著差異(P>0.05)，但咖啡生豆可溶性蛋白質(zhì)含量比對照組A均顯著增加(P<0.05)，增加的可溶性蛋白質(zhì)可能來源于添加的風(fēng)味底物，因為釀酒酵母利用碳水化合物進(jìn)行生長代謝，合成可溶性蛋白質(zhì)的能力較弱。香料組B的還原糖、總蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)含量是所有組中最高的，分別為(8.28±0.39)、(6.34±0.32)、(1.87±0.01)g/100 g，其中還原糖在蘋果組C、甜橙組D中差異顯著(P<0.05)，總蛋白質(zhì)在甜橙組D、香蕉組E中差異顯著(P<0.05)。有研究表明，發(fā)酵后的香草還原糖可達(dá)14.58%，肉桂中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約11.70%[16]，這可能是導(dǎo)致香料組B還原糖、總蛋白質(zhì)最高的原因之一。蘋果組C添加了2.4%蔗糖，發(fā)酵過程中糖會轉(zhuǎn)化為酸類，同時蘋果本身含有大量酸類物質(zhì)，因此蘋果組C的總酸含量在所有組中最高為(7.99±0.49)g/kg與香蕉組E差異顯著(P<0.05)，但與其他組差異不明顯。添加了蔗糖的蘋果組C、甜橙組D、香蕉組E，還原糖的變化情況與對照組A相比參差不齊，排除一定程度上的統(tǒng)計誤差，可認(rèn)為外來糖源的添加會對咖啡豆還原糖含量造成一定影響，其中蘋果組C、甜橙組D與對照組A相比還原糖含量顯著下降(P<0.05)。利用蜂蜜無氧發(fā)酵后，蜂蜜品質(zhì)會降低，酸度增加，總糖和蔗糖含量下降[17]。蜂蜜組F酸度、多糖、還原糖含量與對照組A相比有變化，但變化不明顯(P>0.05)，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為(3.16±0.09)g/100 g與對照組A、蘋果組C、甜橙組D差異顯著(P<0.05)，將其烘焙后進(jìn)行風(fēng)味主觀評價發(fā)現(xiàn)其酸味過重。

從理化分析結(jié)果來看，添加不同底物與咖啡發(fā)酵對咖啡豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05)，但可顯著提高可溶性蛋白質(zhì)的含量(P<0.05)，而風(fēng)味底物的添加對最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質(zhì)、多酚具有不同的影響，表現(xiàn)為有的增加有的減少，有些顯著有些不顯著，變化無明顯規(guī)律，可能是受到添加風(fēng)味底物本身的影響。

2.2 混合發(fā)酵咖啡生豆香氣分析

利用GC-IMS對發(fā)酵后的咖啡生豆香氣進(jìn)行測試，在所有樣品中共檢出包括未知成分在內(nèi)的53種化合物，結(jié)合GC-IMS自帶譜庫及NIST譜庫共定性出36種共有化合物，分別為9種酯類、6種酮類、8種醛類、6種醇類、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類以及檢出17 個共有信號的未知成分(圖1)。通過計算相對含量(圖2)，所有咖啡生豆中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質(zhì)的60%以上，這4大類成分含量和豐富度也較高。添加不同的底物進(jìn)行發(fā)酵會導(dǎo)致咖啡生豆中酮、醛、醇類(除蜂蜜組F外)含量均下降，酯類、烯萜、呋喃(除香料組B外)含量上升。

圖1 混合發(fā)酵后的咖啡生豆揮發(fā)性香氣相對含量熱圖Fig.1 Heat map of relative contents of volatile aroma in coffee beans after mixed fermentation

圖2 混合發(fā)酵咖啡生豆香氣成分相對含量匯總Fig.2 Summary of relative contents of aroma components of coffee beans after mixed fermentation

在A～F組發(fā)酵后的咖啡生豆香氣中，丙酮相對含量最高為12.6%～18.6%，在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后丙酮(辛辣、微甜、愉悅香氣、帶特征性芳香)、甲基異丁酮(香蕉、水果甜、愉悅香氣)、2-丁酮含量均有不同程度下降，其他酮類化合物有增有減。

生豆醛類物質(zhì)中以壬醛(果味、脂肪、玫瑰香)、己醛(果味、木質(zhì)味、蘋果味、草味、橙子味)、2-甲基丁醛(可可味、咖啡味、果味甜)為主各占4.25%～4.75%、3.55%～5.96%、1.51%～5.72%。在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后己醛、2-甲基丁醛、丁醛(發(fā)霉、雜味、發(fā)酵刺激味)、3-甲基丁醛(蘋果味、脂肪、杏仁味)、戊醛均有不同程度下降，其他醛類化合物有增有減。

生豆醇類物質(zhì)中以乙醇(愉悅的酒精味)、異丙醇(尖銳、不愉快的燃燒味)為主，各占6.02%～7.13%、2.73%～3.18%，在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后乙醇、正戊醇、正己醇均有不同程度下降，3-甲基-3-丁烯-1-醇(水果香、草本、木質(zhì)、甜美)有不同程度上升，其他醇類化合物的相對含量有增有減。

生豆中酯類物質(zhì)最為豐富，以乙酸乙酯(香蕉、蘋果味、白葡萄、果香、甜美)、異戊酸乙酯(果味、酒味、甜味、發(fā)酵乳味)、乙酸丙酯(梨、覆盆子味、愉悅的苦甜)為主，各占2.81%～10.79%、1.05%～6.59%、1.52%～2.22%。在添加風(fēng)味底物發(fā)酵后乙酸乙酯、異戊酸乙酯大幅度上升，丁酸乙酯不同程度上升，乙酸丁酯(果味、菠蘿味)、乙酸丙酯、己酸乙酯(果味、菠蘿味、香蕉味、煙味)下降，其他酯類化合物的相對含量有增有減。在酯類化合物中E組添加了香蕉的發(fā)酵咖啡酯類含量增加最為明顯，這與香蕉本身所帶有的酯類香氣物質(zhì)存在較大關(guān)系。大量增加的乙酸乙酯和異戊酸乙酯能為咖啡香氣增加獨(dú)特的果香，與此同時E組酮類中丙酮、醛類中己醛、庚醛(果味、不愉快的脂肪味)、丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛下降最明顯，這在烘焙咖啡豆風(fēng)味主觀評價中也得以體現(xiàn)。

烯萜具有香料香味，月桂烯(甜美、香酯、玫瑰、芹菜、胡蘿卜、薄荷、柑橘、熱帶水果味)、檸檬烯(甜橙、柑桔味)分別有類似肉桂和檸檬清淡的香氣，生豆中烯萜類中香料組B添加了肉桂和香草的咖啡苯乙烯大幅度增加318.52%，甜橙組D添加了甜橙的咖啡檸檬烯大幅增加501.72%。香料組B、甜橙組D在最終烘焙后風(fēng)味主觀評價中也能夠表現(xiàn)出相應(yīng)桂皮、香草、橙香。

香料、水果與咖啡發(fā)酵可以使得香料、水果本身所帶有的香氣賦予咖啡，提升咖啡花果香特質(zhì)，蜂蜜與咖啡發(fā)酵在香氣方面未發(fā)現(xiàn)有突出特點(diǎn)，不同香料、水果對咖啡果香味提升有不同針對，因此如需特定提升某種花果香味尚需進(jìn)行進(jìn)一步的配比調(diào)和研究。

2.3 混合發(fā)酵后的烘焙咖啡豆風(fēng)味感觀評價結(jié)果

對混合發(fā)酵后的烘焙咖啡豆風(fēng)味進(jìn)行感觀評價，得分見表2。香料組B和甜橙組D達(dá)到精品咖啡標(biāo)準(zhǔn)，得分超過80分，風(fēng)味描述上可明顯辨識出精品咖啡中所希望呈現(xiàn)出的桂皮、香草、甜橙等加分風(fēng)味。B～E組評分均高于對照組A，說明添加香料及水果在低溫厭氧條件下利用釀酒酵母發(fā)酵咖啡鮮果對最終的烘焙咖啡豆風(fēng)味有一定提升。但蜂蜜組F酸度過高，風(fēng)味主觀評價分低于對照組A，主要與釀酒酵母利用蜂蜜中糖類發(fā)酵產(chǎn)酸有關(guān)。烘焙咖啡豆風(fēng)味主觀評價結(jié)果中所有樣品均存在酸度偏高、風(fēng)味單一、苦味突出且醇厚度低的問題。這與釀酒酵母發(fā)酵糖類產(chǎn)酸有關(guān)，苦味主要來源于咖啡中綠原酸和咖啡因的變化。在利用釀酒酵母發(fā)酵咖啡增香的同時，如何抑制咖啡酸苦味的增加需進(jìn)一步研究。

表2 混合發(fā)酵后的烘焙咖啡豆風(fēng)味感觀評分Tab.2 Sensory score of flavor of roasted coffee beans after mixed fermentation

3 結(jié) 論

利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下添加天然風(fēng)味底物與咖啡發(fā)酵，與無底物對照組相比發(fā)酵后的咖啡生豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05)，可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著提高(P<0.05)，而底物的添加對最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質(zhì)、多酚具有不同程度的影響，無明顯規(guī)律。對發(fā)酵后的咖啡生豆進(jìn)行GC-IMS香氣分析，共定性出 36種共有化合物，9種酯、6種酮、8種醛、6種醇、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類及17個共有未知信號成分。其中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質(zhì)的60%以上。對發(fā)酵后烘焙咖啡豆風(fēng)味進(jìn)行主觀評價，表明香料、水果與咖啡發(fā)酵可使其香氣賦予咖啡，提升咖啡花果香特質(zhì)，其中香料組、甜橙組風(fēng)味主觀評價達(dá)精品咖啡標(biāo)準(zhǔn)，香蕉組香氣較為突出。蜂蜜組在香氣方面未有突出特點(diǎn)，酸度較高、甜度不足。綜合理化、香氣成分和風(fēng)味主觀評價結(jié)果來看，添加天然風(fēng)味底物并利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下發(fā)酵云南咖啡鮮果，能在一定程度上改善咖啡風(fēng)味品質(zhì)。