郝儀銘，楊玉紅，劉小芳，吳 昊，王保珍，杜 磊,*

(1.山東大學(xué) 齊魯醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，山東 濟(jì)南 250012；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

腸道不僅是負(fù)責(zé)食物消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的器官，也是阻止腸道內(nèi)致病菌和內(nèi)毒素如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)侵入體內(nèi)的屏障[1]。腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障，完整的腸黏膜屏障可將腸腔與機(jī)體內(nèi)環(huán)境隔開，防止腸腔內(nèi)的病原體或有害物質(zhì)向腸腔外組織和器官移位[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，腸黏膜屏障損傷與炎癥性腸病、肥胖、胰島素抵抗及糖尿病等多種疾病相關(guān)，因此，尋求有效維持腸黏膜屏障完整性的營養(yǎng)干預(yù)措施將有助于預(yù)防上述疾病的發(fā)生。

南極磷蝦油(krill oil,KO)以南極磷蝦(Euphausiasuperba)為原料提取精制而成，因富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosapentenoic acid,DHA)等ω-3系多不飽和脂肪酸、磷脂以及蝦青素等多種生物活性成分，具有抗氧化、抗炎等多種生理活性[6-8]。有文獻(xiàn)報道[9-10]，富含DHA和EPA的魚油(fish oil,FO)可保護(hù)腸黏膜屏障。與傳統(tǒng)魚油不同，KO中EPA和DHA主要結(jié)合在磷脂上，具有更高的生物利用率[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，KO能有效改善潰瘍性結(jié)腸炎，然而，KO對腸黏膜屏障損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制鮮見報道。腸道中富含革蘭陰性菌，LPS是其細(xì)胞壁的主要成分，腸道易受膳食或病理性應(yīng)激等因素影響促使LPS大量釋放，導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生，造成腸黏膜屏障功能受損，破壞腸黏膜屏障的完整性[14-18]，因此，LPS被廣泛用于腸黏膜屏障損傷模型的建立[19-20]。本研究擬以改善腸道炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，并以富含甘油三酯型EPA和DHA的FO為對照，探討KO預(yù)防性干預(yù)對LPS所致腸黏膜屏障損傷的預(yù)防作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性6周齡C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物實(shí)驗(yàn)將嚴(yán)格遵照山東大學(xué)公共衛(wèi)生倫理委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑

KO和FO，分別由青島南極維康生物科技有限公司和山東禹王制藥有限公司提供。組分分析結(jié)果顯示：KO和FO中EPA和DHA含量大致相同，EPA和DHA分別占KO總脂肪酸質(zhì)量的22.89%和13.83%，而FO則為23.61%和13.84%，此外，KO中磷脂占比55.06%，蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為232.15mg/kg；LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)試劑盒和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒，購自南京建成生物工程有限公司；一氧化氮試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)和動物組織RNA提取試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，購自日本TaKaRa公司；兔抗Claudin-1、Occludin和Zonula occludens-1(ZO-1)，購自武漢Proteintech公司；兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor kappa-B alpha,IκBα)、phosphorylated-IκBα、核因子κB (NF-κB)p65、phosphorylated-NF-κB p65、GAPDH以及山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，均購自美國Cell Signaling Technology公司。本研究所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3 儀器與設(shè)備

M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Centrifuge 5430R型臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Microm EC 350-1型石蠟包埋機(jī)、HM325型石蠟切片機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司；Light Cycler 480型實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)，瑞士Roche公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；5200 Multi型全自動化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組8只：正常組、模型組(LPS)、南極磷蝦油組(KO)和魚油組(FO)。以橄欖油作為溶劑稀釋KO和FO，參考《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量(2013版)》中關(guān)于成人對DHA+EPA的推薦攝入量，以400 mg/kg(以體重計(jì))的劑量灌胃小鼠[21]，灌胃體積為0.1 mL/20 g(以體重計(jì))，每日1次，持續(xù)4周。正常組和模型組小鼠灌胃橄欖油，末次灌胃24 h后，給予正常組小鼠注射生理鹽水，其余小鼠腹腔注射劑量為10 mg/kg(以體重計(jì))的LPS。6 h后取血并脫頸處死小鼠，取腸道組織用預(yù)冷生理鹽水沖洗，取小腸末端固定于10%的中性福爾馬林溶液中，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，其余部分于-80 ℃凍存待用。

1.4.2腸道病理學(xué)觀察

將固定于10%的中性福爾馬林溶液的小腸經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋，常規(guī)切片(厚度5 μm)，65 ℃烘烤2 h，脫蠟至水。HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察腸道病理學(xué)改變情況，使用Image Pro Plus 6.0軟件測量腸絨毛長度與隱窩深度。

1.4.3血清中DAO活性的測定

取血后在4 ℃條件下以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，分離血清，凍存于-80 ℃待用。根據(jù)試劑盒說明書要求檢測血清中DAO濃度。

1.4.4腸道生化指標(biāo)的測定

根據(jù)試劑盒說明書要求進(jìn)行小腸組織勻漿，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定勻漿中蛋白濃度，檢測DAO和MPO活性以及一氧化氮含量。

1.4.5蛋白免疫印跡檢測

提取小腸蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加入一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜，加入二抗，室溫孵育1h；洗膜、顯色、曝光。利用圖像分析軟件Image J對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4.6PCR檢測

利用試劑盒提取小腸組織總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用單因素方差分析比較各組間差異，若P<0.05則認(rèn)為結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 KO對小鼠腸道組織病理學(xué)變化的影響

利用HE染色觀察小鼠小腸組織病理學(xué)變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知：正常組小鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，隱窩淺且界限明顯；LPS組小鼠腸絨毛排列紊亂且有頂端缺失情況，隱窩深且界限不明顯，部分腸上皮層與固有層分離。由圖1(a)和(b)可知：與FO組相比，KO預(yù)防性干預(yù)可顯著改善腸道損傷狀況，并能顯著抑制LPS所致腸絨毛長度與隱窩深度比值的降低(P<0.01)。小腸絨毛長度與隱窩深度的比值是評價腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS的刺激可顯著降低小腸絨毛長度與隱窩深度的比值；KO和FO預(yù)防性干預(yù)能有效抑制LPS所致小腸絨毛長度與隱窩深度比值的降低，且KO效果較FO更為顯著。這與已有研究結(jié)果一致[22-23]。

小腸HE染色切片放大倍數(shù)為200倍。#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；&表示與KO組相比差異顯著(P<0.05)，&&表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 KO對經(jīng)LPS處理后小鼠腸道形態(tài)的影響Fig.1 Effect of KO on intestinal morphology in LPS-treated mice

2.2 KO對小鼠血清和腸道DAO活性以及緊密連接蛋白表達(dá)的影響

小腸DAO活力以蛋白含量計(jì)。#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖2 KO對經(jīng)LPS處理后小鼠腸黏膜屏障功能的影響Fig.2 Effect of KO on intestinal barrier function in LPS-treated mice

本研究通過考察血清和小腸組織DAO活性以及腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)情況,探討KO對LPS所致小鼠腸黏膜屏障通透性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。DAO作為腸上皮細(xì)胞中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在腸黏膜屏障受損時會釋放入血，使腸道中DAO含量減少，因此可作為檢測腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)[24]。由圖2(a)和(b)可知：LPS的刺激可明顯提高小鼠血清中DAO活性(P<0.01)并降低小腸組織中DAO活性(P<0.01)；KO和FO預(yù)防性干預(yù)則可顯著抑制血清DAO活性的升高并增強(qiáng)小腸組織中DAO活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KO和FO能顯著降低血清中DAO活性并維持小腸DAO活性，減輕LPS所致腸黏膜屏障損傷。

腸黏膜屏障以機(jī)械屏障最為重要。腸上皮細(xì)胞間緊密連接是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障最重要的部分，主要由跨膜蛋白Claudin、Occludin家族以及胞漿蛋白ZO等緊密連接蛋白組成，對維持腸黏膜上皮細(xì)胞極性及調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的通透性發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。由圖2(c)、(d)、(e)和(f)可知：與正常組小鼠相比，LPS的刺激可顯著降低腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)水平，破壞腸黏膜屏障的完整性；KO和FO預(yù)防性干預(yù)可顯著阻止LPS所致Claudin-1、Occludin以及ZO-1蛋白表達(dá)的降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，KO能有效維持腸黏膜屏障功能。

2.3 KO對小鼠腸道炎癥反應(yīng)的影響

LPS通過誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥反應(yīng)破壞腸黏膜屏障的完整性。本研究考察了KO對LPS所致小鼠腸道炎癥反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。MPO是一種主要由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的酶，反映中性粒細(xì)胞浸潤程度，而中性粒細(xì)胞募集是重要的炎癥標(biāo)志物，因此MPO活性可間接反映炎癥損傷程度[26]。由圖3(a)可知：與正常組小鼠相比，LPS組小鼠小腸中MPO活性顯著升高(P<0.01)；KO和FO預(yù)防性干預(yù)可顯著抑制MPO活性升高，減輕腸道炎癥損傷程度。

浸潤的中性粒細(xì)胞和受LPS刺激的腸上皮細(xì)胞會表達(dá)iNOS蛋白，進(jìn)而催化產(chǎn)生大量一氧化氮，造成腸黏膜屏障功能損傷[27]。由圖3(b)、(c)和(d)可知：與正常小鼠相比，LPS組小鼠小腸中iNOS蛋白表達(dá)以及一氧化氮含量顯著增加；KO和FO預(yù)防性干預(yù)可顯著降低iNOS蛋白表達(dá)以及一氧化氮含量，從而減輕腸道炎癥損傷程度。

一氧化氮含量以蛋白質(zhì)量計(jì)。#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；&表示與KO組相比差異顯著(P<0.05)，&&表示差異極顯著(P<0.01)。圖3 KO對經(jīng)LPS處理后小鼠腸道炎性介質(zhì)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of KO on expression of intestinal inflammatory mediators in LPS-treated mice

此外，LPS促使腸道組織釋放大量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，進(jìn)而加重腸道損傷程度。KO對經(jīng)LPS處理后小鼠小腸組織中促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4結(jié)果表明：與正常組相比，LPS組小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)顯著升高；KO和FO預(yù)防性干預(yù)可顯著降低促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，表明KO可顯著改善腸道炎癥反應(yīng)。

2.4 KO對TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平的影響

#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 KO對經(jīng)LPS處理后的小鼠小腸組織中促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of KO on small intestinal mRNA expression of inflammatory cytokines in LPS-treated mice

TLR4/NF-κB信號通路由TLR4、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65以及p-NF-κB p65等關(guān)鍵因子構(gòu)成，調(diào)控下游TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子表達(dá)。研究表明[28-29]，LPS可通過激活腸道組織TLR4信號通路，啟動下游信號級聯(lián)引起IκBα的磷酸化和降解，致使NF-κB的兩個亞基p65和p50入核，通過與靶基因特定區(qū)域相結(jié)合啟動炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促使TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)與釋放，造成腸黏膜損傷。為了闡明KO改善LPS所致腸黏膜屏障損傷的分子機(jī)制，本研究考察了KO對小腸組織中TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。圖5顯示：LPS的刺激可顯著增加小鼠小腸組織中TLR4的蛋白表達(dá)以及IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平；KO和FO預(yù)防性干預(yù)能有效抑制LPS所致TLR4、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的增加。結(jié)果表明，KO可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。

#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；&表示與KO組相比差異顯著(P<0.05)，&&表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 KO對經(jīng)LPS處理后小鼠小腸組織中TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of KO on small intestinal protein expression of key factors involved in TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-treated mice

3 結(jié) 論

本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷小鼠模型，系統(tǒng)考察了KO對LPS所致小鼠腸黏膜屏障損傷的預(yù)防作用及機(jī)制。研究結(jié)果表明：KO預(yù)防性干預(yù)能顯著抑制LPS所致小鼠小腸腸絨毛長度與隱窩深度比值的降低；下調(diào)血清DAO水平，提高小腸DAO活性，增加腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)水平；抑制過氧化物酶活性、iNOS蛋白表達(dá)和NO含量的升高，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)以及TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。KO可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮其抗炎活性，進(jìn)而有效預(yù)防LPS所致腸黏膜屏障損傷，且其作用效果優(yōu)于DHA和EPA含量大致相同的FO。KO是一種新型海洋功能型脂質(zhì)，市場潛力巨大，希望本研究結(jié)果可為因腸黏膜屏障損傷引起的相關(guān)疾病的預(yù)防以及KO的深度開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。