陳貝貝，彭志蘭，章超樺,2，*，林海生,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，曹文紅,2，秦小明,2

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院/國(guó)家貝類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034)

牡蠣(Crassostreahongkongensis)，廣泛分布于中國(guó)廣東、廣西等南部海域，富含蛋白質(zhì)、糖原和?；撬岬榷喾N營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有“海中牛奶”之稱(chēng)[1]。牡蠣具有獨(dú)特的保健功能和藥用價(jià)值，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《海藥本草》等記載,牡蠣具有重鎮(zhèn)安神、去煩熱等功效[2]；另外，柴胡加龍骨牡蠣湯具有抗抑郁作用，且效果顯著。抑郁癥是多發(fā)于各個(gè)年齡層的常見(jiàn)神經(jīng)疾病。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展與腦內(nèi)神經(jīng)炎癥和氧化損傷相關(guān)[3]。有研究證明，牡蠣肉水提液可以改善腦部氧化應(yīng)激和腦衰老，提高大腦海馬區(qū)大錐體細(xì)胞數(shù)，提高腦部超氧化物歧化酶含量，降低丙二醛含量[4]；此外，牡蠣提取物對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞也具有保護(hù)作用[5]。已有研究表明，牡蠣酶解產(chǎn)物具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗衰老[6-9]等活性，然而，目前關(guān)于牡蠣是否能夠改善抑郁的相關(guān)研究較少，因此，牡蠣酶解產(chǎn)物是否具有抗抑郁作用有待進(jìn)一步探究。

斑馬魚(yú)作為新型模式生物，具有成本低、用藥量少等多種優(yōu)點(diǎn)[10]，可以高通量地進(jìn)行活性物質(zhì)篩選；同時(shí)，斑馬魚(yú)與人類(lèi)有高達(dá)70%以上基因同源性[11]，并且有類(lèi)似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)形態(tài)[12-14]，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于神經(jīng)行為學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究具備很大的潛力[15-16]。目前，國(guó)外對(duì)斑馬魚(yú)在神經(jīng)方面的研究較為完善，國(guó)內(nèi)關(guān)于斑馬魚(yú)相關(guān)研究較少，并且主要集中在利用斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物毒性篩選，并未對(duì)其進(jìn)行有效的開(kāi)發(fā)利用。為了探究牡蠣酶解產(chǎn)物的抗抑郁作用及其潛在機(jī)理，本研究選用成年斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)抑郁樣模型，擬通過(guò)藥物暴露方式補(bǔ)充牡蠣酶解產(chǎn)物，采用新穎環(huán)境測(cè)試和光暗箱等行為學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)牡蠣酶解產(chǎn)物干預(yù)對(duì)斑馬魚(yú)抑郁行為的改善作用；計(jì)算斑馬魚(yú)體重指數(shù)，測(cè)定斑馬魚(yú)外周組織中糖皮質(zhì)激素水平以及大腦中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)、抗炎因子IL-10和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等表達(dá)水平，進(jìn)而研究牡蠣酶解產(chǎn)物潛在的抗抑郁機(jī)理，希望為牡蠣酶解產(chǎn)物抗抑郁活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)以及活性成分的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～5個(gè)月月齡成年野生型近交短尾斑馬魚(yú)(雄雌比例約為1∶1)，購(gòu)自上海乙諾水族科技有限公司，并安置在小型魚(yú)飼養(yǎng)設(shè)施中，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境安靜。

1.2 材料與試劑

新鮮香港牡蠣，購(gòu)于廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng)。香港牡蠣廣泛分布于中國(guó)廣東、廣西等南部海域，是南海重要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，因此，本實(shí)驗(yàn)選用香港牡蠣作為實(shí)驗(yàn)原料。

動(dòng)物蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司，酶活力為3×105U/g；氟西汀，常州四藥制藥有限公司；E112-01/02，BCA蛋白含量試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚(yú)腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒、斑馬魚(yú)皮質(zhì)醇(CORT)ELISA 試劑盒、斑馬魚(yú)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA 試劑盒、斑馬魚(yú)腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA 試劑盒、斑馬魚(yú)白細(xì)胞介素10(IL-10)ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Lynx 6000型高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash型多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific 公司；R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FDU-1100型真空冷凍干燥機(jī)，日本東京理化器械株式會(huì)社；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；手工勻漿器。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1牡蠣酶解物制備

牡蠣酶解物(oyster hydrolysates，OHs)，參照李婉等[17]的方法制備并稍加改進(jìn)。將牡蠣肉與3倍體積的蒸餾水(g:L)進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加酶量1 000 U/g，于53 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解5 h，100 ℃沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻至室溫后離心。在4 ℃下以8 000 r/min離心20 min，過(guò)濾去除雜質(zhì)，取上清液進(jìn)行濃縮，經(jīng)冷凍干燥后得OHs。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

斑馬魚(yú)以每組15條魚(yú)飼養(yǎng)在6 L帶有過(guò)濾裝置和供氧裝置的小水箱里，水箱中水溫 (25±2)℃,pH值7.0～7.4，溶解氧量(8.5±1.2)mg/L，12 h循環(huán)光暗交替。斑馬魚(yú)每日投喂飼料2次(上午8點(diǎn)，下午6點(diǎn))，每次投喂量1.5 g/kg，飼養(yǎng)至少14 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(飼養(yǎng)條件及飼料投喂量參考文獻(xiàn)[18-19])。斑馬魚(yú)給藥劑量參考文獻(xiàn)[20]中的急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)：將斑馬魚(yú)分別浸泡在100、200、400、800、1 600 mg/L牡蠣酶解液中，1 h后發(fā)現(xiàn)800、1 600 mg/L組斑馬魚(yú)頭部有紅斑，100、200、400 mg/L組斑馬魚(yú)頭部無(wú)紅斑，確定斑馬魚(yú)最大耐受劑量為600 mg/L；將最大耐受劑量作為高劑量組，并依次3倍遞減濃度確定中劑量組和高劑量組給藥濃度。斑馬魚(yú)具體分組及給藥劑量情況見(jiàn)表1。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白對(duì)照組不作任何應(yīng)激及藥物處理，用藥組在應(yīng)激的第4周開(kāi)始給藥，每天上午8:30喂食后給藥，給藥完成后對(duì)其進(jìn)行應(yīng)激處理。給藥方式為：將給藥組的斑馬魚(yú)分別撈出至相應(yīng)藥物濃度的1.5 L塑料容器中(容器中裝有0.5 L相應(yīng)濃度的藥物)，藥物暴露30 min，給藥方式參考文獻(xiàn)[21]。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量Tab.1 Grouping of experimental animals and dosages

1.4.3斑馬魚(yú)抑郁模型構(gòu)建與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1)實(shí)驗(yàn)造模。選用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激斑馬魚(yú)抑郁模型。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁動(dòng)物模型目前應(yīng)用較為廣泛，該模型與抑郁癥發(fā)病過(guò)程具有高度的相似性。主要通過(guò)捕食者暴露、食物剝奪、黑暗處理、擁擠環(huán)境等應(yīng)激項(xiàng)目對(duì)斑馬魚(yú)造成不可預(yù)知的慢性應(yīng)激。應(yīng)激流程參考Song等[21]35 d斑馬魚(yú)慢性不可預(yù)知模型，并稍加改動(dòng)，第25天的應(yīng)激項(xiàng)目更換為黑暗處理。

2)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。參考Egan等[22]新穎環(huán)境實(shí)驗(yàn)(NTT)和Cachat等[23]光暗箱實(shí)驗(yàn)(LDB)，記錄斑馬魚(yú)在測(cè)試模型中的行為，進(jìn)而分析斑馬魚(yú)抑郁樣行為是否得到改善。在實(shí)驗(yàn)的第36天，上午9點(diǎn)至下午2點(diǎn)之間，對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

NTT行為學(xué)測(cè)試:將預(yù)處理的斑馬魚(yú)隨著其生活水緩慢倒入梯形測(cè)試水槽中，用高清攝像頭記錄斑馬魚(yú)在水槽中上部停留時(shí)間(在水槽上部所有停留時(shí)間)，記錄時(shí)長(zhǎng)為5 min。NTT行為學(xué)設(shè)備為一個(gè)1.5 L梯形水箱(高度15 cm×頂部長(zhǎng)度28 cm×底部長(zhǎng)度23 cm×寬度7 cm)，將梯形水箱最大程度裝滿(mǎn)水，并通過(guò)線(xiàn)條在設(shè)備外部標(biāo)記為兩個(gè)相等的虛擬水平。

LDB行為學(xué)測(cè)試:將預(yù)處理的斑馬魚(yú)隨著其生活水緩慢從黑暗區(qū)倒入光暗箱中，用高清攝像頭記錄斑馬魚(yú)在光暗箱中的黑暗區(qū)潛伏期(從黑暗處第一次來(lái)到光亮處前持續(xù)時(shí)間)和在光亮處停留時(shí)間，記錄時(shí)長(zhǎng)5 min。LDB行為學(xué)設(shè)備為一個(gè)12 L矩形水箱(高度20 cm×長(zhǎng)度30 cm×寬度20 cm)，以中線(xiàn)為界限，一半采用無(wú)光線(xiàn)黑暗遮光處理。

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，以冰浴的方式犧牲動(dòng)物，并記錄每條斑馬魚(yú)體重及體長(zhǎng)。在冰面快速解剖斑馬魚(yú)，解剖頭部取腦。將組織標(biāo)本過(guò)液氮后迅速放于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.4.4外周組織中皮質(zhì)醇含量測(cè)定

取出魚(yú)身組織，按質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。用手工勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20 min(3 000 r/min)，仔細(xì)收集上清液并分裝。測(cè)定魚(yú)身組織蛋白濃度，具體實(shí)驗(yàn)操作參考BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參考斑馬魚(yú)皮質(zhì)醇ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定外周組織中皮質(zhì)醇含量。

1.4.5魚(yú)腦組織炎癥相關(guān)細(xì)胞因子含量測(cè)定

魚(yú)腦樣本處理方式同1.4.4。采用斑馬魚(yú)TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA試劑盒測(cè)定魚(yú)腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.4.6魚(yú)腦組織腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量測(cè)定

魚(yú)腦樣本處理方式同1.4.4。采用斑馬魚(yú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子ELISA試劑盒測(cè)定魚(yú)腦中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)采用JMP Pro13軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Origin 2017和Excel等軟件制圖。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異性顯著分析，采用最小二乘均值Studentt檢驗(yàn)判斷組間差異。所有分析中，組間差異顯著以P<0.05表示，組間差異極顯著以P<0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)抑郁樣行為的影響

慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激的小鼠和大鼠抑郁樣模型是目前抑郁癥研究領(lǐng)域使用最廣泛的模型，近年來(lái)對(duì)斑馬魚(yú)也建立了相應(yīng)的慢性應(yīng)激抑郁樣模型[21,24-25]。目前對(duì)斑馬魚(yú)抑郁樣行為的測(cè)定主要采取NTT和LDB兩個(gè)行為學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。斑馬魚(yú)進(jìn)入陌生的新環(huán)境，需要一個(gè)探索和適應(yīng)的過(guò)程。在NTT測(cè)試中，把斑馬魚(yú)放進(jìn)新環(huán)境測(cè)試水槽中時(shí)，大部分斑馬魚(yú)會(huì)游到水槽底部或者角落，直到它們適應(yīng)周?chē)h(huán)境，才會(huì)開(kāi)始試探性地慢慢擴(kuò)大游動(dòng)范圍向上部游動(dòng)；在新環(huán)境中，斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間與魚(yú)的緊張焦慮程度呈負(fù)相關(guān)。在LDB測(cè)試中，把斑馬魚(yú)放進(jìn)光暗箱中時(shí)，大部分斑馬魚(yú)會(huì)偏好光線(xiàn)比較弱的地方，直到它們適應(yīng)周?chē)h(huán)境，才會(huì)慢慢從黑暗區(qū)游出開(kāi)始向光亮區(qū)游動(dòng)。在新環(huán)境中，斑馬魚(yú)在光亮區(qū)停留時(shí)間與魚(yú)的緊張焦慮程度呈負(fù)相關(guān)，游出黑暗處所需的時(shí)間(也就是在黑暗區(qū)潛伏期)和魚(yú)的緊張焦慮程度呈正相關(guān)。在NTT和LDB行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，每組選取12條斑馬魚(yú)，進(jìn)行行為學(xué)觀(guān)察，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

通過(guò)NTT行為學(xué)實(shí)驗(yàn)得到圖1。由圖1可知，與空白組相比，應(yīng)激模型組(斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間極顯著減少，此現(xiàn)象與Egan等[22]新穎環(huán)境測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說(shuō)明應(yīng)激組斑馬魚(yú)出現(xiàn)了明顯的焦慮行為；與應(yīng)激模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間極顯著增加，說(shuō)明陽(yáng)性藥物氟西汀對(duì)緩解斑馬魚(yú)焦慮行為有很好的效果；同時(shí)，與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間均有不同程度的顯著增加，說(shuō)明低、中、高濃度的牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)焦慮行為有明顯改善。伴隨著牡蠣酶解物給藥劑量的增加，斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間先上升后下降，中劑量組斑馬魚(yú)在上部停留時(shí)間最長(zhǎng)，其改善斑馬魚(yú)在NTT行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中焦慮行為效果最好。

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖1 牡蠣酶解物對(duì)NTT實(shí)驗(yàn)中斑馬魚(yú)行為的影響Fig.1 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in NTT experiment

通過(guò)LDB行為學(xué)實(shí)驗(yàn)得到圖2。由圖2(a)可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚(yú)在黑暗區(qū)潛伏期時(shí)間極顯著增加，由圖2(b)可知，應(yīng)激模型組在光亮區(qū)停留時(shí)間顯著減少，此現(xiàn)象與Cachat等[23]光暗箱測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說(shuō)明模型組的斑馬魚(yú)行為焦慮程度明顯高于空白組；與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚(yú)在光亮區(qū)停留時(shí)間均有不同程度的顯著增加，在黑暗區(qū)潛伏期均有不同程度的減小，中劑量組在黑暗區(qū)潛伏期最短而且在光亮區(qū)停留時(shí)間最長(zhǎng)，均表現(xiàn)出明顯的改善焦慮行為的作用，說(shuō)明中劑量組改善斑馬魚(yú)在光暗箱中焦慮行為效果最佳。

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2 牡蠣酶解物對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)中斑馬魚(yú)行為的影響Fig.2 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in LDB experiment

由圖1和圖2可知，在一定藥物劑量范圍內(nèi)，隨著藥物濃度增高，斑馬魚(yú)抑郁行為改善效果越明顯，具有一定的劑量依賴(lài)性。中劑量組牡蠣酶解物在NTT和LDB行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中均對(duì)斑馬魚(yú)焦慮行為改善效果最好，反而過(guò)高的藥物劑量對(duì)斑馬魚(yú)焦慮行為并沒(méi)有更好的改善。這個(gè)現(xiàn)象可能是因?yàn)楦邼舛鹊哪迪犆附馕锶芤罕旧硇任哆^(guò)大，而斑馬魚(yú)嗅覺(jué)十分敏感[26]，太腥的氣味容易對(duì)斑馬魚(yú)造成一定的應(yīng)激。Oliveira等[27]研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)暴露于死亡物種的氣味中也會(huì)表現(xiàn)出防御狀態(tài)，且皮質(zhì)醇含量上升，而長(zhǎng)期的高水平皮質(zhì)醇會(huì)進(jìn)一步刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，致其功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致大腦海馬受到損傷。另一種可能是，濃縮食品提取物的暴露會(huì)改變水質(zhì)參數(shù)(如pH值或滲透壓)，從而進(jìn)一步間接給斑馬魚(yú)帶來(lái)壓力。因此，牡蠣酶解物高劑量組可能不是最佳給藥劑量組，具體原因需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)體重指數(shù)的影響

經(jīng)歷慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激的動(dòng)物體重會(huì)顯著下降[28]，體重和體重指數(shù)(BMI)都是反映機(jī)體胖瘦的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，體重指數(shù)是目前最常用的一個(gè)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也是衡量魚(yú)類(lèi)胖瘦程度的非常重要的指標(biāo)[29]。Dreimüller等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在抗抑郁治療反應(yīng)過(guò)程中，伴隨患者抑郁程度的降低，患者BMI有升高的現(xiàn)象。本研究采用斑馬魚(yú)體重(g)與體長(zhǎng)(cm2)的平方之比[30],來(lái)計(jì)算BMI。由斑馬魚(yú)BMI得圖3，由圖3可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚(yú)體重指數(shù)極顯著下降；與應(yīng)激模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組斑馬魚(yú)體重指數(shù)極顯著上升，說(shuō)明陽(yáng)性藥物對(duì)改善應(yīng)激后斑馬魚(yú)體重指數(shù)下降有很好的效果；與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚(yú)體重指數(shù)均有不同程度的顯著增加，說(shuō)明低、中、高濃度的牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)體重下降均有明顯的改善，中劑量組改善斑馬魚(yú)體重下降效果最好。

2.3 牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)外周組織皮質(zhì)醇含量的影響

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖3 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)體重指數(shù)的影響Fig.3 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish body mass index

皮質(zhì)醇是一種糖皮質(zhì)激素。機(jī)體分泌過(guò)多的皮質(zhì)醇會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞被損壞，抑制正常的下丘腦-垂體-腎上腺軸負(fù)反饋機(jī)制；過(guò)高水平的皮質(zhì)醇進(jìn)而過(guò)度刺激大腦海馬皮質(zhì)醇受體，使海馬正常功能受到損傷，并導(dǎo)致海馬5-羥色胺和去甲腎上腺素缺乏癥，影響行為認(rèn)知功能，這些變化與抑郁癥患者腦部神經(jīng)中樞變化的觀(guān)察結(jié)果一致[31]。斑馬魚(yú)外周組織皮質(zhì)醇含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚(yú)魚(yú)身組織內(nèi)皮質(zhì)醇的含量顯著增加；與應(yīng)激模型組相比，陽(yáng)性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組使用藥物之后，顯著減少了慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)皮質(zhì)醇含量的增加。這種現(xiàn)象說(shuō)明，牡蠣酶解物降低了斑馬魚(yú)的皮質(zhì)醇含量，有助于調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸的負(fù)反饋以及減少對(duì)海馬的損害，進(jìn)而改善抑郁狀態(tài)。中劑量組降低斑馬魚(yú)皮質(zhì)醇在魚(yú)身中表達(dá)的效果最好。

2.4 牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)腦部炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的影響

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖4 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)外周皮質(zhì)醇含量的影響Fig.4 Effect of oyster hydrolysates on peripheral cortisol content of zebrafish

細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞分泌的生物活性蛋白，它們是細(xì)胞之間的信息傳遞者，有協(xié)調(diào)免疫反應(yīng),參與神經(jīng)化學(xué)和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌的作用。膠質(zhì)細(xì)胞可被視為腦內(nèi)特化的免疫細(xì)胞，主要由小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)產(chǎn)生。當(dāng)BV2受到應(yīng)激時(shí)，被激活的BV2可表現(xiàn)為兩種狀態(tài)，M1型BV2主要分泌致炎因子，M2型BV2分泌抗炎因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。

TNF-α和IL-1β是炎癥細(xì)胞因子的重要成員，他們的表達(dá)水平與抑郁程度呈正相關(guān)。TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和JNK等信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，同時(shí)它們能促進(jìn)下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，最終導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)分泌更多的糖皮質(zhì)激素，破壞下丘腦-垂體-腎上腺軸的正常調(diào)節(jié)機(jī)制，并進(jìn)一步導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素水平上升、海馬受損，這些現(xiàn)象與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。斑馬魚(yú)腦組織TNF-α和IL-1β的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)應(yīng)激后，斑馬魚(yú)腦內(nèi)TNF-α的含量極顯著增加，IL-1β的含量顯著增加；與應(yīng)激模型組相比，使用低劑量組、中劑量組和高劑量組牡蠣酶解物之后，顯著減少了慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)腦部TNF-α含量的增加，中劑量組降低斑馬魚(yú)TNF-α腦內(nèi)含量效果最為顯著；給藥后斑馬魚(yú)腦部IL-1β含量也不同程度的降低，由表2知，中劑量組降低IL-1β腦內(nèi)含量效果最好，但無(wú)顯著性差異。本研究表明，低、中、高濃度的牡蠣酶解物能通過(guò)改變斑馬魚(yú)腦部的組織炎癥因子含量來(lái)改善斑馬魚(yú)抑郁樣行為，其中中劑量組降低斑馬魚(yú)腦部炎癥因子含量效果最好，尤其是對(duì)TNF-α含量的降低起了很重要的作用。

表2 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)腦部致炎因子含量的影響Tab.2 Effect of oyster hydrolysates on contents of inflammatory factors in brain of zebrafish pg/mg

IL-10作為一種重要的抗炎和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，能夠通過(guò)激活JAK1/STAT3信號(hào)通路下調(diào)Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用。IL-10還能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞生成促炎癥因子,從而降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性,促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TGF-β,減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[32]。斑馬魚(yú)腦組織IL-10的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)應(yīng)激后，腦內(nèi)IL-10水平極顯著高于空白組；酶解物低劑量組和中劑量組腦內(nèi)IL-10 含量高于應(yīng)激組，但無(wú)顯著差異，這可能是由于成年斑馬魚(yú)有很強(qiáng)的神經(jīng)修復(fù)能力。Zhang等[33]對(duì)損傷誘導(dǎo)的成年斑馬魚(yú)腦再生進(jìn)行長(zhǎng)期體內(nèi)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)大腦組織在損傷后的第43天完全恢復(fù)，這說(shuō)明斑馬魚(yú)在接收到應(yīng)激帶來(lái)的損傷時(shí)，能迅速進(jìn)行自我修復(fù)，這一現(xiàn)象與Song等[21]實(shí)驗(yàn)中得到的應(yīng)激后腦內(nèi)IL-10含量較空白組升高的研究結(jié)果相似。

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖5 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)腦部抗炎因子IL-10含量影響Fig.5 Effect of oyster hydrolysates on contents of anti-inflammatory factors IL-10 in brain of zebrafish

2.5 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖6 牡蠣酶解物對(duì)斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量的影響Fig.6 Effect of oyster hydrolysates on BDNF content in zebrafish brain

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類(lèi)對(duì)神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化，影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成和神經(jīng)元的可塑性。斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)過(guò)應(yīng)激后，斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量顯著升高(P<0.05)，這與斑馬魚(yú)較強(qiáng)的神經(jīng)自我修復(fù)能力有關(guān)，這一現(xiàn)象與Song等[21]發(fā)現(xiàn)的斑馬魚(yú)應(yīng)激后腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量較空白組升高的研究結(jié)果相似；與應(yīng)激模型組相比，中劑量組增加了斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量，但無(wú)顯著性差異；與陽(yáng)性組相比，使用低劑量組、中劑量組牡蠣酶解物之后，均不同程度地增加了斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量，其增加效果不顯著。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激之后，斑馬魚(yú)在行為學(xué)測(cè)試中的表現(xiàn)為探索行為降低，趨暗行為增強(qiáng)，焦慮程度增加；斑馬魚(yú)體重指數(shù)降低；斑馬魚(yú)組織中的炎癥因子和皮質(zhì)醇水平升高。

經(jīng)過(guò)牡蠣酶解產(chǎn)物的給藥后，與應(yīng)激模型組相比，低、中、高劑量組牡蠣酶解產(chǎn)物給藥組的斑馬魚(yú)探索能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為在上部停留時(shí)間升高；趨暗行為減弱，表現(xiàn)為在黑暗區(qū)潛伏期明顯縮短，在光亮區(qū)停留時(shí)間明顯升高，說(shuō)明斑馬魚(yú)抑郁樣行為得到改善；斑馬魚(yú)體重指數(shù)明顯升高，外周組織皮質(zhì)醇水平明顯降低，且腦組織中的炎癥因子如TNF-α水平也明顯降低，說(shuō)明牡蠣酶解產(chǎn)物可以降低斑馬魚(yú)組織中的TNF-α和皮質(zhì)醇的水平，抑制炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到改善抑郁的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解產(chǎn)物可以通過(guò)調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇水平以及抑制慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)改善斑馬魚(yú)的抑郁樣行為；中劑量組對(duì)斑馬魚(yú)抑郁樣行為改善效果較好，可以顯著改善斑馬魚(yú)抑郁樣行為，降低斑馬魚(yú)外周皮質(zhì)醇含量，降低腦部促炎細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)。