陸彭城，張文春，陳建芳，黃學(xué)敏，葉 菁，彭東輝，*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350000； 2.龍巖新羅區(qū)林業(yè)局，福建 龍巖 364000； 3.泉州永春縣林業(yè)局，福建 泉州 362000； 4.福州植物園，福建 福州 350000)

錦香草屬(Phyllagathis)是野牡丹科(Melastomataceae)蜂斗草族(Sonerileae)舊世界熱帶的一個大屬。中國的錦香草屬有28種，5變種，主要分布于四川、貴州、江西、福建、湖南等省。錦香草(Phyllagathiscavaleriei)及其近緣種用途廣泛，為民間常用的中草藥，具止血、止痛、祛瘀等功效，極具藥用價值；此外，錦香草還是優(yōu)良的鄉(xiāng)土植物，具有很高的觀賞價值[1-2]。

錦香草屬自成立以來，關(guān)于該屬的分類關(guān)系爭議不斷，尤其是關(guān)于我國的類群，分類關(guān)系反復(fù)修改，仍不完善[3]。其中，錦香草種內(nèi)分類關(guān)系混亂，與其近緣種短毛熊巴掌(P.cavalerieivar.tankahkeei)、長柄熊巴掌(P.cavalerieivar.wilsoniana)和貓耳朵(P.wenshanensis)界定模糊，《Flora of China》[4]將《中國植物志》[1]中錦香草3個近緣種種名歸并為錦香草異名，該做法有待進(jìn)一步探討。前人關(guān)于錦香草及其近緣種的分類學(xué)研究存在所取樣品數(shù)量有限、所采用的分子標(biāo)記方法提供的有效信息位點有限、未獲得令人信服的支持率等問題[5-9]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列是分子標(biāo)記片段常用的有核基因組標(biāo)記，不僅適用于探討屬間、種間，以及種下水平等較低分類階元的系統(tǒng)分類，也適用于研究種群間、野生種和栽培種之間的親緣關(guān)系[6]。因此，本文利用ITS序列對錦香草及其近緣種植物進(jìn)行全面細(xì)致的分類學(xué)研究，以期更好地開發(fā)利用錦香草種質(zhì)資源，為雜交育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2019年，多次分時段在浙江、福建、江西、廣東、廣西、湖南等地開展野生種資源調(diào)查時采集錦香草材料，并進(jìn)行實地拍照、調(diào)查記錄各樣品的野外生境與生長狀況(圖1)。在不濫采、不破壞生態(tài)環(huán)境的前提下，少量采集樣品并引種于福建農(nóng)林大學(xué)(26°05′20″N， 119°13′45″E)蘭苑溫室種植。本研究共選取46份材料，包括37份錦香草屬植物及其近緣種，以及9份野牡丹科植物(包含8個屬的模式種，部分序列從GenBank下載)，其中異藥花(Fordiophytonfaberi)、偏瓣花(Plagiopetalumesquirolii)、柏拉木(Blastuscochinchinensis)、野海棠(Brediahirsute)和紅敷地發(fā)(Phyllagathiselattandra)作為ITS外類群。具體植物材料樣品的學(xué)名、來源、GenBank登錄號見表1。

表1 樣品的基本信息

1.2 DNA提取

提取無病害幼嫩葉片的DNA，取樣前先用蒸餾水洗凈葉片表面，裝入自封袋中并做好標(biāo)記帶回實驗室。參照何雪嬌等[7]改良的CTAB法提取DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 ITS序列擴增與測序

PCR反應(yīng)體系5 μL：在DNA模板中加入引物(4×10-12mol)、10×測序緩沖液4 μL，最后加DNA測序試劑至總體積為5 μL。引物序列ITS-17SE：5′-ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG-3′；ITS-26SE：5′-GAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3′[8]。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。待反應(yīng)結(jié)束后取3 μL PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后的DNA條帶送至福州博尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

先將序列峰圖文件(.ab1)用SeqMan5.0軟件手動進(jìn)行校對和拼接，以獲得質(zhì)量較高的ITS序列；再將序列復(fù)制到Notepad++軟件中保存為fasta文件(.fasta)，用MEGA5軟件中的Muscle對拼接好的序列進(jìn)行比對，同時適當(dāng)?shù)厥謩诱{(diào)整序列首尾兩側(cè)，當(dāng)兩側(cè)堿基不足時以“？”補足；將ITS數(shù)據(jù)集合并成矩陣進(jìn)行序列長度和GC含量分析，并以Kimura 2參數(shù)計算遺傳距離。最后將ITS數(shù)據(jù)集合并成矩陣進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并另存為fasta文件(.fasta)備份數(shù)據(jù)。在CIPRES Science Gateway網(wǎng)站上使用最大似然法(maximum likelihood，ML)，設(shè)置1 000次重復(fù)的自展分析和GTRGAMMA模型來評估系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。最后用Adobe Illustrator CS6和Adobe Photoshop CS6軟件對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行后續(xù)的編輯和美化。

A1、A2，錦香草；B1、B2，短毛熊巴掌；C1、C2，長柄熊巴掌。A1 and A2， P. cavaleriei; B1 and B2， P. cavaleriei var. tankahkeei; C1 and C2， P. cavaleriei var. wilsoniana.圖1 錦香草及其近緣種的花與葉片F(xiàn)ig.1 Flowers and leaves of P. cavaleriei and its related species

續(xù)表1 Continued Table 1

續(xù)表1 Continued Table 1

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列比較

對所有測序材料進(jìn)行ITS序列比對分析：序列長度為717～783 bp，總GC含量為58.6%～61.2%，高于AT含量，表明該序列對GC堿基具有偏向性。保守位點(conserved site)582個，占總位點數(shù)的72.21%；變異位點(variable site)共202個，占25.06%；信息位點(parsim-info site)84個，占10.42%。其中，錦香草、短毛熊巴掌與長柄熊巴掌的5.8S序列長度較為一致，為160～161 bp，其中GC含量為53.1%～53.4%，保守位點65個，變異位點數(shù)96個，信息位點僅有10個(表2)。與5.8S序列相比，ITS序列的變異更加豐富，ITS1序列長度為246 bp，GC含量為63.4%～65.8%，有保守位點18個，占總數(shù)的8.37%；變異位點達(dá)229個，占91.23%；信息位點145個，占比57.77%。ITS2的序列長度為230 bp，GC含量為62.6%～66.5%，保守位點34個，占總位點數(shù)的14.22%；變異位點共有197個，占比82.43%；信息位點87個，占36.4%。

表2 供試樣本ITS序列長度和GC含量Table 2 Length and GC content of ITS sequence of samples

2.2 遺傳距離與ITS系統(tǒng)樹分析

基于K2P模型對實驗材料進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果(表3)表明，錦香草與短毛熊巴掌遺傳距離較小，平均僅為0.008，親緣關(guān)系近；而與長柄熊巴掌遺傳距離較大，平均遺傳距離達(dá)0.039，最遠(yuǎn)為來自四川的長柄熊巴掌與貴州的短毛熊巴掌，距離為0.044。長柄熊巴掌與不同來源地錦香草、短毛熊巴掌的最小遺傳距離的值均大于錦香草與短毛熊巴掌的最大遺傳距離。

表3 ITS片段的遺傳距離Table 3 Genetic distance of ITS sequences

基于ITS序列進(jìn)行ML樹構(gòu)建，結(jié)果(圖2)顯示，37份錦香草及其近緣種植物分為2個Clade，構(gòu)成姐妹支(BSML=71)。其中Clade 1(BSML=100)共包括34個樣品，由所有錦香草和短毛熊巴掌互相穿插嵌套構(gòu)成，各個地區(qū)的錦香草和短毛熊巴掌交叉聚在一起，表明各地域錦香草和短毛熊巴掌親緣關(guān)系較近；3份長柄熊巴掌單獨聚成Clade 2(BSML=100)，與錦香草屬模式種圓葉錦香草(P.rotundifoliaMG644436.1)、長穗花(StyrophytoncaudatumMG644474.1)、光萼八蕊花(Sporoxeialatifoliavar.fengii376)和藥囊花(Cyphothecamontana361)構(gòu)成姐妹支。

圖2 基于ITS序列的錦香草及其近緣種的ML樹Fig.2 Phylogenetic relationships of P.cavaleriei and its related species based on ITS sequences

3 結(jié)論與討論

ITS序列的進(jìn)化速率較快，在植物屬間和種間具有較多的變異位點和信息位點，是用來探討植物種內(nèi)、種間，以及近緣種間變異的有效分子手段之一[10-11]。遺傳距離是種間基因差異程度的數(shù)值度量方式，常用遺傳系統(tǒng)樹加以表達(dá)。本研究中利用ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，長柄熊巴掌與錦香草、短毛熊巴掌的最小遺傳距離大于錦香草與短毛熊巴掌之間的最大遺傳距離，因此，通過三者遺傳距離的比較可以區(qū)分出長柄熊巴掌，長柄熊巴掌與另外二者之間存在較大的基因差異。這一點在進(jìn)化樹中更為直觀，長柄熊巴掌單獨聚為一支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，錦香草與短毛熊巴掌聚為同一進(jìn)化分支且相互交叉顯示出極近的親緣關(guān)系。以上結(jié)果表明，ITS序列能夠在分子水平上將長柄熊巴掌單獨分類鑒定出來，錦香草與短毛熊巴掌相互交叉難以鑒定，這在分子水平上為錦香草與短毛熊巴掌同種異名提供了證據(jù)。結(jié)合ITS數(shù)據(jù)的鑒定結(jié)果，支持錦香草和短毛熊巴掌為同種異名，長柄熊巴掌為獨立進(jìn)化支。

錦香草和短毛熊巴掌均有按來源地聚類的趨勢但并不完全一致。在短毛熊巴掌中湖南舜皇山(HNSHS018、HNSHS025)、廣西(GXSTS035、GXYSGY036)和福建(FJGYS039、FJJDS097)的樣品嵌入不同來源地的錦香草中，其余短毛熊巴掌樣品都聚在了一起，并有按地域聚類的趨勢；錦香草聚類結(jié)果的地域性更強，在錦香草分布中，先是貴州小丹江樣品按地域來源聚在一起，廣西金秀和圣堂山樣品聚在一起，來自廣東石門臺和丹霞山的樣品聚在一起；然后，貴州雷公山全部樣品也按地域來源聚在一起，接著廣西(桂平、金秀、玉林和蓮花山)、湖南舜皇山和廣東南嶺聚在一起。大部分錦香草有按地域聚類的趨勢，小部分如江西齊云山(JXQYS 100)和湖南永州(HNYZ 098)嵌套在了福建吉當(dāng)山的短毛熊巴掌、廣西和貴州的錦香草之間。長柄熊巴掌則與錦香草屬模式種圓葉錦香草、長穗花、光萼八蕊花和藥囊花構(gòu)成姐妹支，這也與Zhou等[13]的研究結(jié)果一致。綜合所有聚類結(jié)果與地域關(guān)系的比較，錦香草更多按來源地聚類在一起，而短毛熊巴掌按地域關(guān)系聚類到同一支的趨勢弱，表明錦香草相對短毛熊巴掌而言具有更強的地域性。

有關(guān)ITS序列差異鑒定與地理分布的研究已有很多報道。莫忠妹等[14]研究表明，nrITS序列可用來鑒定21個不同地區(qū)薤白(Alliummacrostemon)的親緣關(guān)系；趙芹等[15]研究表明，ITS序列可區(qū)分不同產(chǎn)地瓠瓜(Lagenariasiceraria)品種的親緣關(guān)系，不同產(chǎn)地品種間存在豐富的遺傳變異和地理分化現(xiàn)象；劉長命等[16]通過ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，不同生境萱草(Hemerocallisfulva)存在豐富的遺傳變異和多樣性，但未發(fā)現(xiàn)其與地理分布呈一定關(guān)系。本研究中，錦香草與短毛熊巴掌相互嵌入，且來自同一地區(qū)的顯示出按地域特征的規(guī)律性聚集，長柄熊巴掌單獨聚為一支無明顯地域特征。結(jié)果表明，ITS序列在種內(nèi)關(guān)系不同的物種之間所顯示出的地域性特征也不同，符合王談笑等[17-18]的研究結(jié)果。

錦香草及其近緣種在自然界中存在較為廣泛，進(jìn)行了大量的天然雜交，由此采用經(jīng)典形態(tài)分類較為困難。本次研究基于ITS構(gòu)建的ML樹分析結(jié)果表明，ITS序列差異與地理分布存在一定的關(guān)系，ML樹的親緣關(guān)系結(jié)果支持《Flora of China》將短毛熊巴掌處理為錦香草的異名，而長柄熊巴掌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，應(yīng)為獨立進(jìn)化支，支持將其獨立為一個種。