成 平，周 翔，張三勇，姜文玲，許向青，朱雪婧，夏運成

中南大學湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科/腎臟疾病與血液凈化學湖南省重點實驗室,湖南長沙 410011

近年來，單克隆免疫球蛋白(M蛋白)相關(guān)疾病逐漸受到臨床醫(yī)生的關(guān)注與重視，涉及科室廣泛，除血液科、腎內(nèi)科對相關(guān)檢查有較深了解外，大部分科室(如心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、消化內(nèi)科、脊柱外科、老年病科、風濕免疫科等)對M蛋白檢測技術(shù)和結(jié)果解讀知之較淺，以致不能精準判斷患者的病情進展及療效。免疫固定電泳是利用區(qū)帶電泳的分離作用與抗體特異性免疫沉淀標記作用相結(jié)合的定性檢測技術(shù)，是目前對M蛋白檢測與分型應(yīng)用最多、最廣的技術(shù)[1-2]。免疫固定電泳結(jié)果的解讀存在較多主觀因素，需要檢驗技術(shù)人員具有扎實的理論基礎(chǔ)知識和豐富的閱片經(jīng)驗。本文擬借助1例不常見免疫固定電泳結(jié)果的處理與分析，以期提高臨床、檢驗相關(guān)人員對M蛋白檢測技術(shù)的深入了解和重視，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，57歲，發(fā)現(xiàn)無誘因雙下肢水腫半月余。門診檢查示：尿蛋白定性4+，血清蛋白36.9 g/L，血肌酐55.1 μmol/L,以“蛋白尿待查”收入中南大學湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科。否認肝炎、結(jié)核等急慢性傳染病史，否認高血壓及心臟病史，否認糖尿病及腎臟病史，無外傷及手術(shù)史，無藥物過敏史，無輸血史，預(yù)防接種史不詳。查體：體溫36.5 ℃，脈搏86次/分，呼吸20次/分，血壓122/78 mm Hg。精神可，查體合作，問答切題，其他查體無陽性指征。

1.2方法

1.2.1免疫固定電泳 采用美國海倫娜(Helena)公司的全自動電泳儀spife3000及其原裝免疫固定電泳試劑盒，按照標準操作規(guī)程對血清、尿液標本分別進行電泳和結(jié)果分析。β巰基乙醇處理：常規(guī)處理血清標本的β巰基乙醇濃度為1%，處理時間15～20 min。本文采用β巰基乙醇處理尿液標本，為避免稀釋尿液標本，采用798 μL 尿液標本加入2 μL β巰基乙醇(巰基乙醇終末濃度為0.25%)，混勻靜置15 min，再按常規(guī)尿液免疫固定電泳操作。

1.2.2游離輕鏈定量 采用美國貝克曼公司全自動特定蛋白分析儀IMMAGE800及英國BINDING SITE原裝進口游離輕鏈試劑盒，以免疫比濁法進行游離輕鏈定量檢測。

1.2.3其他 生化檢測采用羅氏7600生化儀及配套試劑，免疫全套檢測采用IMMAGE800及配套試劑，尿液蛋白檢測采用西班牙BioSystems公司全自動特定蛋白儀BA400及配套原裝試劑。

2 結(jié) 果

2.1患者血清和尿液常規(guī)免疫固定電泳圖譜 血清常規(guī)免疫固定電泳圖譜λ泳道可見特異性濃集條帶，G、A、M泳道未見特異性條帶。電泳圖譜結(jié)果分析顯示，M蛋白陽性，分型待定，免疫固定電泳需要進一步完善IgD、IgE及fλ。尿液常規(guī)免疫固定電泳圖譜所有泳道未見特異性濃集條帶，M蛋白陰性。見圖1。

注： A為尿液免疫固定電泳圖；B為血清免疫固定電泳圖，箭頭標注為單克隆條帶。

2.2患者免疫球蛋白結(jié)果 IgG：4.49 g/L(7.51～15.60 g/L)，IgA：0.53 g/L(0.82～4.53 g/L)，IgM：0.29 g/L(0.46～3.04 g/L)，IgE：271.90 ng/L(0.00～691.40 ng/L)。本實驗室常規(guī)開展血清游離輕鏈(FLC)定量檢測，該患者血清游離定量結(jié)果 κ-FLC：6.9 mg/L，λ-FLC：535 mg/L，κ-FLC/λ-FLC：0.01，dFLC：525.1 mg/L。

2.3患者血清常規(guī)與非常規(guī)免疫固定電泳圖譜 λ泳道可見濃集條帶，但性質(zhì)不明，之后血清免疫固定電泳加做了抗重鏈δ(IgD)、抗重鏈ε(IgE)、抗fλ。D、E泳道未見蛋白濃集條帶，fλ泳道出現(xiàn)了與λ泳道濃集條帶同水平位置陽性條帶，見圖2。

2.4尿液免疫固定電泳圖譜 尿液中的輕鏈蛋白分子容易發(fā)生聚合而形成二聚體、三聚體、四聚體等，從而導(dǎo)致單克隆的輕鏈蛋白在電泳圖譜上呈彌散分布。鑒于此，特對患者晨尿液標本采用β巰基乙醇(終末濃度為0.25%)處理，最終尿液免疫固定電泳圖譜上λ泳道出現(xiàn)了弱陽性的濃集條帶，但fλ泳道仍未見濃集條帶，見圖3。

注：A為未處理尿液免疫固定電泳圖譜；B為β巰基乙醇處理后的尿液免疫固定電泳圖譜(箭頭處為弱陽性特異性濃集條帶)。

2.5尿液標本經(jīng)β巰基乙醇處理前、后游離輕鏈定量結(jié)果 鑒于尿液標本的常規(guī)免疫固定電泳與β巰基乙醇處理后的免疫固定電泳圖譜結(jié)果不一致，特檢測了處理前、后2份尿液標本的游離輕鏈濃度。結(jié)果顯示，2份尿液標本的λ-FLC濃度相差近1倍，見表1。

表1 尿液標本經(jīng)β巰基乙醇處理前、后游離輕鏈定量結(jié)果

2.6患者腎穿刺活檢病理結(jié)果 免疫熒光(石蠟)：IgG(3+)、C1q(3+)、IgA(-)、IgM(-)、C3(-)、FIB(-)；腎小球：κ(+)階段性沉積于系膜、λ(3+)線性沉積于毛細血管袢；腎間質(zhì)：κ(-)、λ(3+)沉積于腎間質(zhì)。剛果紅染色：陽性。病理結(jié)果提示λ輕鏈型腎淀粉樣變。

3 討 論

M蛋白是骨髓前B細胞惡性增殖產(chǎn)生的一種均一性M蛋白，依據(jù)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)分為：完整型M蛋白、游離輕鏈型M蛋白、重鏈型M蛋白(極其罕見)[3-4]。臨床檢驗中，利用免疫固定電泳技術(shù)檢測M蛋白時需要同時檢測血清和尿液標本，血清免疫固定電泳主要用于檢測完整型M蛋白，尿液免疫固定電泳主要用于檢測輕鏈型M蛋白。

該患者的常規(guī)血清免疫固定電泳λ泳道出現(xiàn)了陽性條帶，免疫固定電泳排查IgD和IgE均為陰性，而fλ出現(xiàn)了與λ同水平位置的陽性條帶，說明該患者血清中的M蛋白是λ型游離輕鏈，血清游離輕鏈定量結(jié)果也佐證了這一結(jié)論。腎臟病理免疫熒光顯示腎小球腎間質(zhì)λ限制性沉積，剛果紅染色陽性明確淀粉樣變性，輕鏈λ型M蛋白陽性也符合臨床病理診斷[4-6]。

輕鏈κ和λ蛋白相對分子質(zhì)量分別為220 00×103和44 000×103，血清中的輕鏈蛋白可以直接通過腎小球濾過漏入尿液中，所以對輕鏈型M蛋白尿液免疫固定電泳檢出率更高。該患者血清免疫固定電泳能檢出游離輕鏈型M蛋白，理論分析應(yīng)該會有一定量的游離輕鏈溢出至尿液中，而該患者的尿液免疫固定電泳圖譜未見M蛋白濃集條帶。本文分析尿液免疫固定電泳陰性有兩種可能的解釋：一方面，腎小管對輕鏈蛋白有一定的代謝能力，溢出的輕鏈蛋白被腎小管代謝后濃度降低，低于電泳的最低檢測限；另一方面，溢出的輕鏈蛋白分子在尿液中形成聚合體，不同相對分子質(zhì)量的聚合體在凝膠區(qū)帶電泳作用下成彌散條帶，且輕鏈蛋白形成各種聚合體后，也弱化了單體的濃度，從而可能低于電泳的最低檢測限。所以該患者的尿液免疫固定電泳圖譜未見特異性濃集條帶。

β巰基乙醇是電泳中常用的蛋白解聚液，用來解離蛋白分子形成的聚合體。β巰基乙醇處理后的免疫固定電泳圖譜λ泳道出現(xiàn)了弱濃集條帶，尿液原本存在的M蛋白顯現(xiàn)出來，這一結(jié)果符合尿液中的輕鏈蛋白發(fā)生聚合的推論。β巰基乙醇處理前、后尿液游離輕鏈定量結(jié)果相差近1倍，本文分析可能是由于聚合體與單體形式的輕鏈分子存在空間構(gòu)象不同，導(dǎo)致與檢測抗體試劑結(jié)合時存在差異，以致定量結(jié)果存在偏差。fλ泳道未出現(xiàn)λ泳道同位置的濃集條帶，是否是抗體的結(jié)合能力強弱差異導(dǎo)致未能檢測到輕鏈蛋白，有待進一步討論和證實。

本文病例提示，免疫固定電泳技術(shù)存在多變性，需要扎實的操作技術(shù)和豐富的閱片經(jīng)驗才能綜合分析得出可靠結(jié)論[7]。免疫固定電泳技術(shù)在M蛋白檢測中應(yīng)用廣泛，但具有一定的檢測局限性，對于低濃度M蛋白和非分泌型多發(fā)性骨髓瘤患者存在漏檢[6]。

FLC定量檢測因其特異性和靈敏度高而備受關(guān)注，是多發(fā)性骨髓瘤診療指南中1項重要的評判指標[8]。FLC定量及其比值對多發(fā)性骨髓瘤有很大的診斷及進展評估價值，對于輕鏈型M蛋白和非分泌型多發(fā)性骨髓瘤患者，F(xiàn)LC的差值也是較好的療效評估指標。免疫固定電泳技術(shù)和游離輕鏈定量聯(lián)合檢測能大大提高臨床對M蛋白相關(guān)疾病的診治水平[9]。