王 健 李雪薇 徐 鈞

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院普外科，太原市 030001，電子郵箱：425505180@qq.com)

胃癌是起源于胃黏膜上皮組織的一種惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球第二，全國第一[1]。尋找相關的腫瘤標志物對于制定胃癌個體化治療方案[2-4]、預后評估、術后復查等均有重大的臨床意義。不育α基序結構域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結構域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)是一種廣泛存在于髓核細胞中的抗病毒蛋白[5]，其可參與病毒復制的逆轉錄過程，調控脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)的水解進程，進而調控DNA復制，發(fā)揮抗病毒的作用[6]。近年來有研究顯示，SAMHD1在結直腸癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、慢性淋巴細胞白血病[10]中存在基因突變現(xiàn)象，可導致SAMHD1表達明顯下調，是一種潛在抑癌基因，其內在機制可能與腫瘤細胞的基因突變、表觀遺傳學的改變有關。但目前尚未有關于SAMHD1在胃癌中作用的研究，而作為廣譜抗病毒和抗腫瘤蛋白，其可能在胃癌中也存在突變現(xiàn)象。本研究探討SAMHD1在胃癌組織中的表達及其與預后的相關性，為尋找胃癌患者的腫瘤標志物、治療靶點和判斷預后提供新方向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年1月至2018年7月在山西省腫瘤醫(yī)院進行手術治療，術后病理明確診斷為胃癌的320例患者的手術標本。納入標準：初診即確診為胃癌的患者。排除標準：(1)術前接受過新輔助放化療治療的患者；(2)合并遠處臟器轉移的患者。其中男性260例，女性60例；年齡≤60歲196例，>60歲124例；腫瘤部位：胃竇部100例，賁門部155例，胃體部65例；病理分期參照2016年10月國際抗癌聯(lián)盟和美國腫瘤聯(lián)合會頒布的第八版胃癌原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結-遠處轉移(tumor-node-metastasis，TNM)分期系統(tǒng)[11]：Ⅰ期47例，Ⅱ期79例，Ⅲ期182例，Ⅳ期12例。本研究通過山西省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 SAMHD1多克隆抗體(生產(chǎn)批號：GR163628-2)購自杭州以恒生物科技有限公司，二抗酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物、磷酸緩沖鹽溶液、二氨基聯(lián)苯胺顯色劑、免疫組化抗原修復緩沖液(統(tǒng)一生產(chǎn)編號：G24958)購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 免疫組化試驗方法 將胃癌組織經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋，切片，厚度約4 μm。對組織切片進行常規(guī)脫蠟、水化，采用過氧化氫去離子水孵育，阻斷內源性過氧化物酶的干擾。將脫蠟后的石蠟切片置于切片架上，加入免疫組化抗原修復緩沖液(高pH，50×)，確保組織完全浸沒在溶液中，然后采用高壓法進行抗原修復，加熱10 min后自然冷卻20 min，確保抗原充分修復。隨后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次。取出切片，將3%過氧化氫與組織避光孵育15 min后，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次。然后滴加50 μL 兔抗SAMHD1多克隆抗體工作液于組織上，4℃冰箱孵育過夜。一抗孵育完畢，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗切片3次，3 min/次。再滴加50 μL二抗于組織上，室溫孵育20 min；孵育完畢，將切片置入磷酸緩沖鹽溶液中沖洗3次，3 min/次，取出切片。同時配置DAB工作液，按每毫升顯色緩沖液(B液)中加入DAB顯色劑(A液)約40 mL的比例配置免疫顯色試劑，混勻后，滴加配好的DAB工作液50 μL于切片上，室溫孵育5 min顯色。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木素復染，各級乙醇(70%～100%)脫水，每級3 min。取出切片置于二甲苯5 min，用中性樹膠封片。

1.4 免疫組化結果判讀 細胞膜或細胞質內觀察到棕黃色顆粒定義為陽性。選取染色均勻的陽性表達區(qū)域，統(tǒng)計5個高倍視野下陽性細胞的計數(shù)及染色強度。按陽性細胞率，陽性細胞率<5%為0分，6%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分；按著色強度分為不著色、淡黃色、深黃色，分別計0、1、2分。將陽性細胞率計分和著色強度計分相加，最終得分0分為陰性(-)，得分1～2分為弱陽性(+)，得分3～4分為陽性(++)，得分5分為強陽性(+++)。SAMHD1表達陽性包括陽性和強陽性。所有判讀結果均由兩名及以上臨床病理醫(yī)師負責判讀，當出現(xiàn)不同的判讀結果時，由兩名醫(yī)師協(xié)商確認判讀結果。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用Cox風險模型分析患者預后的影響因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SAMHD1在胃癌組織中的表達情況 免疫組化分析結果顯示，SAMHD1在胃癌組織中的陽性表達率高達75.9%(243/320)，見表1、圖1。

表1 SAMHD1在胃癌組織中的表達情況

圖1 免疫組化分析結果

2.2 SAMHD1表達與臨床病理特征的關系 SAMHD1的表達情況與患者的性別和腫瘤原發(fā)部位無相關關系(均P>0.05)，但與患者的年齡和臨床分期相關(均P<0.05)，見表2。

表2 SAMHD1表達與臨床病理特征的關系(n)

2.3 SAMHD1表達與預后的關系 對320例患者進行隨訪，總體生存時間為手術開始至死亡或隨訪結束(截止日期2020年7月)，平均隨訪時間53個月，中位隨訪時間為65個月。以胃癌術后患者的生存時間作為因變量，以臨床上認為對患者的預后有影響的變量(性別、年齡、腫瘤臨床分期、SAMNHD1表達情況、腫瘤原發(fā)部位)作為自變量，采用Cox比例風險回歸模型進行單因素分析，變量賦值情況見表3。結果顯示，SAMHD1表達情況、年齡、臨床分期、腫瘤原發(fā)部位是胃癌患者預后的影響因素(均P<0.05)，見表4。將上述單因素分析中具有統(tǒng)計學意義的變量作為協(xié)變量，納入Cox比例風險回歸模型中進行多因素預后分析，結果顯示SAMHD1表達情況和臨床分期均是胃癌患者預后的獨立影響因素(均P<0.05)，見表5。

表3 變量賦值情況

表4 影響胃癌患者預后的單因素Cox 比例風險模型分析

表5 影響胃癌患者預后的多因素Cox比例風險模型分析

2.4 SAMHD1表達陽性患者和表達陰性患者預后的比較 Kaplan-Meier分析結果顯示，SAMHD1表達陽性患者的中位生存期為61個月，高于SAMHD1表達陰性患者的中位生存期25個月(χ2=9.147，P=0.002)，生存曲線見圖2。

圖2 SAMHD1表達陽性和表達陰性患者的生存曲線比較

3 討 論

胃癌是來源于胃黏膜上皮細胞的一種惡性消化道腫瘤，新發(fā)病例數(shù)逐年升高[12]。早期胃癌的臨床表現(xiàn)無特異性，常以上腹部不適、噯氣、呃逆等為先導癥狀，容易與胃的良性疾病混淆，使早期胃癌的診斷率下降。由于進展期胃癌死亡率高，5年生存率低于30%，且手術風險大，醫(yī)療資源消耗大，因此需要尋找合適的篩查、評估預后的手段[13]。SAMHD1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種天然廣譜抗病毒基因產(chǎn)物，隨著對SAMHD1基因研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)SAMHD1基因在多種腫瘤疾病中存在不同程度的變異，導致SAMHD1異常表達。在衰老導致的老年肺癌患者中，SAMHD1出現(xiàn)低表達現(xiàn)象[8]，而同樣的現(xiàn)象也在肝癌[9]中被證實。研究發(fā)現(xiàn)，SAMHD1可通過調控p27來抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，使早期腫瘤細胞比例與高表達的p27和SAMHD1水平呈正相關[9]。因此，SAMHD1可能是一種潛在的抗腫瘤蛋白，本研究探討其在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者臨床特征的關系，為胃癌的診斷、治療、發(fā)病機制研究提供參考。

本研究中，胃癌組織SAMHD1陽性表達率高達75.9%，且SAMHD1的表達與患者的年齡、臨床分期相關(均P<0.05)。Cox比例風險模型分析結果顯示，SAMHD1表達和臨床分期均是胃癌患者預后的獨立影響因素(均P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果提示，SAMHD1表達陽性的胃癌患者的生存期長于SAMHD1表達陰性患者(P<0.05)。以上結果提示，SAMHD1表達陽性是胃癌患者預后的獨立保護因素，其獨特的抗病毒、調控細胞周期作用，可能也在惡性腫瘤組織中發(fā)揮作用。對結直腸癌患者進行研究發(fā)現(xiàn)[7]，SAMHD1基因在腸癌中的突變降低了SAMHD1在腫瘤組織中的表達，導致脫氧核糖核苷三磷酸酶不同程度的活性降低，導致dNTP生物降解程度變慢，破壞原有的dNTP池平衡，為腫瘤細胞DNA復制提供充足的dNTP，說明低表達的SAMHDA1是結直腸癌腫瘤生長的促進因素。結合本研究結果，SAMHD1在胃癌腫瘤細胞的生長過程中發(fā)揮著與脫氧核糖核苷三磷酸酶相似的作用，可以更好地穩(wěn)定dNTP池[14]，調控DNA復制的底物濃度[15]，限制腫瘤的生長，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，影響胃癌患者的預后。另外，SAMHD1可以調控長散布元件基因的表達下游產(chǎn)物開放閱讀框蛋白(open reading frame 2 protein，ORF2p)[16]。ORF2p的主要作用是調控DNA的反轉錄過程，然而，受到SAMHD1影響后，ORF2p在腫瘤細胞中表達下降，從而抑制逆轉錄轉座子的活性，延緩DNA反轉錄的過程，進而減緩細胞周期，影響腫瘤細胞的生長[17]，這可能是SAMHD1影響腫瘤患者預后的機制之一，但SAMHD1在胃癌發(fā)病中的內在機制還需要進一步研究。

綜上所述，胃癌組織中的SAMHD1廣泛表達，且其與部分臨床病理特征相關，SAMHD1表達陽性是胃癌患者預后的獨立保護因素。SAMHD1作為一個在多種腫瘤中存在廣泛突變的基因，對其進行深入研究，有助于探討腫瘤內在的發(fā)生和發(fā)展機制，為早期胃癌的診斷、預后判斷提供依據(jù)。