李 博，陳中元，王京仁，王貴平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.常德市農(nóng)業(yè)大分子研究中心，湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000）

1 發(fā)病情況

據(jù)場負責(zé)人反映，該場存欄經(jīng)產(chǎn)母豬400頭，肥育豬600頭，在2020年11月斷奶仔豬轉(zhuǎn)保育舍時，發(fā)現(xiàn)有仔豬腹瀉，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，且病死率比較高。仔豬死亡前耳朵發(fā)紫，同舍豬也陸續(xù)出現(xiàn)死亡。

2 臨床癥狀

送檢的4頭仔豬體溫在39～41 ℃，被毛粗亂，消瘦，眼瞼腫脹，精神沉郁；其中有兩只的耳部、背部、腹下發(fā)紺明顯，并且皮膚有出血斑點，后軀無力，四肢劃動，呼吸困難。在解剖前有2頭已經(jīng)死亡。

3 病理變化

將送檢的4頭仔豬在指定的隔離區(qū)進行解剖并詳細記錄剖檢變化。經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，4頭仔豬腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大，有心包積水，肺出血，呈間質(zhì)性肺炎；腎臟表面有出血點且被膜易剝離；脾臟腫大，肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)、腫大。

4 實驗室診斷

4.1 材料

4.1.1 樣品處理 采集病豬的腎臟、淋巴結(jié)、肺等組織，取約1 g左右放入研磨管，加入適量生理鹽水，進行充分研磨，研磨成勻漿后，移入1.5 mL離心管，4 ℃ 10 000 r/min，離心5 min，取上清液0.2 mL待用。

4.1.2 主要設(shè)備和試劑 主要檢測儀器：美國BIO-RAD公司熒光定量PCR儀、德國Biometra梯度PCR儀檢測實驗室室溫25 ℃（表1）。

表1 主要試劑及廠家

4.2 診斷方法

4.2.1 豬藍耳病病毒實時熒光PCR檢測 參照病毒核酸提取試劑盒說明書，提取組織樣品中豬藍耳病病毒RNA；按照豬藍耳病病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（40個循環(huán)）。

4.2.2 豬圓環(huán)病毒2型實時熒光PCR檢測 參照病毒核酸提試劑盒說明書，提取組織樣品中豬圓環(huán)病毒2型DNA；按照豬圓環(huán)病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（35個循環(huán)）。

4.2.3 豬藍耳病病毒陽性樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄 若對豬藍耳病病毒檢測出現(xiàn)陽性，參照BioRT Master逆轉(zhuǎn)錄擴增（RT-PCR）試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min（35個循環(huán)）。

4.2.4 豬藍耳病病毒陽性樣品測序 對豬藍耳病病毒陽性樣品進行測序，并與不同藍耳病毒株進行序列比對。

5 結(jié)果

5.1 熒光定量PCR檢測結(jié)果

經(jīng)熒光定量PCR檢測。4份樣品中，豬藍耳病病毒陽性樣品3份，1份樣品為可疑結(jié)果，豬圓環(huán)病毒2型陽性樣品4份。

5.2 豬藍耳病病毒陽性樣品測序

用測序引物對1號、2號、3號、4號樣品進行RT-PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果1號、2號、3號陽性樣品出現(xiàn)目的條帶，4號可疑樣品沒有出現(xiàn)目的條帶，4份PCR擴增結(jié)果詳見圖1。將3個豬藍耳病病毒檢測陽性樣品的目的條帶切下，并分別裝入離心管中做好標(biāo)記，送往湖南擎科生物科技有限公司進行測序。

圖1 4份豬藍耳病病毒樣品PCR擴增結(jié)果

5.3 豬藍耳病病毒基因遺傳進化分析

將3個藍耳病陽性樣品的基因與基因庫中藍耳病病毒毒株進行遺傳進化關(guān)系對比。結(jié)果如圖2，1號、2號、3號在同一個大分支上。1號、2號、3號與15HUN3、JXA1-P160等高致病性毒株在同一個大分支上。說明它們的親緣關(guān)系較近。1號、2號、3號與CH-1R、NADC30、CH-1a等低致病性毒株不在同一分支上，說明它們的親緣關(guān)系較遠。

圖2 豬藍耳病病毒株基因序列遺傳進化樹

5.4 豬藍耳病病毒同源性序列分析

從同源性序列對比圖3中可以看出，1號樣品與HUN4的相似度最高，為98.9%；2號樣品與HUN4的相似度最高，為99.6%；3號樣品與JXA1-P160的相似度最高，為100%。

圖3 豬藍耳病病毒株同源性序列對比

5.5 結(jié)論

根據(jù)序列分析得出的結(jié)果可知，3個藍耳病陽性分離株與高致病性毒株的同源性最高，推測這3個藍耳病陽性分離株為高致病性毒株。并參考臨床癥狀和解剖病變診斷，該豬場暴發(fā)的病情為高致病性豬藍耳病和豬圓環(huán)病毒2型混合感染。

6 討論

通過同源性序列對比圖可知1號、2號樣品與HUN4的相似度最高，而3號樣品與JXA1-P160的相似度為100%。說明該豬場已經(jīng)存在高致病性豬藍耳病病毒的流行。應(yīng)該對豬群進行緊急接種，并對全場實行封閉管理，進出的車輛進行嚴格的消毒。對圈舍定期清理，通過通風(fēng)、換氣等措施提高空氣質(zhì)量。禁用變質(zhì)的飼料，適量的飼喂青綠飼料，做到營養(yǎng)均衡[1]。定期進行水質(zhì)測試，確保為豬提供清潔的水源[2]。對發(fā)病豬舍進行徹底消毒，對病死豬進行無害化處理，空欄7～10 d再進豬。必須隔離和觀察新引進的種豬，采取免疫措施，并對所在豬舍進行嚴格消毒[3]。

本次實驗室檢測的4份樣品中，高致病性豬藍耳病與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染率為75%。近年來，隨著豬場集約規(guī)?；l(fā)展，養(yǎng)殖密度也越來越大，病毒病以及多種病毒病混合感染的發(fā)生率也越來越大[4]，其中最常見的就是豬藍耳病與豬圓環(huán)病的混合感染[5]。豬藍耳病是一種傳染性很高，致病力很高的傳染病。它的傳播途徑有很多種，如空氣，豬群間等，對養(yǎng)豬業(yè)有很大的影響[6]。豬圓環(huán)病毒2型可侵害豬的神經(jīng)、呼吸、消化等系統(tǒng)，使機體發(fā)生綜合性衰竭，該病在仔豬中發(fā)病率高達50%，致死率為20%[7]。養(yǎng)豬場須解決當(dāng)前在豬常見傳染病免疫工作中的缺陷，嚴格按照國家要求采取有力措施，有效做好豬疫病的免疫、預(yù)防和控制，并盡可能防止豬病的發(fā)生。