王玲，李金環(huán)，黃海燕，吳強(qiáng)

研究報(bào)告

串聯(lián)反向CTCF位點(diǎn)的系列刪除揭示增強(qiáng)子調(diào)控基因簇表達(dá)的平衡

王玲，李金環(huán)，黃海燕，吳強(qiáng)

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

三維基因組染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF (CCCTC-binding factor)能夠介導(dǎo)增強(qiáng)子與基因啟動(dòng)子的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，也可以結(jié)合調(diào)控區(qū)域的絕緣子發(fā)揮增強(qiáng)子絕緣功能，對(duì)發(fā)育中的基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用。同源框基因家族(Homeobox gene family,)編碼一類控制動(dòng)物發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育中主要沿胚胎首尾軸(head-to-tail axis)呈時(shí)空線性表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，基因分為、和四個(gè)基因簇，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼和四肢發(fā)育中發(fā)揮重要功能?；虼刂饕{(diào)控四肢發(fā)育，受位于其兩側(cè)調(diào)控域內(nèi)的增強(qiáng)子調(diào)節(jié)，沿肢體近遠(yuǎn)軸(proximal-distal axis)呈時(shí)空線性表達(dá)。在人類基因組中，基因簇及其兩側(cè)的調(diào)控區(qū)域分布有串聯(lián)排列的CTCF結(jié)合位點(diǎn)(簡稱CTCF位點(diǎn))，參與9個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。本研究以基因簇為模式基因，探究CTCF對(duì)發(fā)育基因(developmental genes)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)在人HEK293T細(xì)胞中獲得一系列的串聯(lián)反向CTCF位點(diǎn)刪除的單細(xì)胞克隆株。RNA-seq實(shí)驗(yàn)揭示CTCF位點(diǎn)刪除后基因表達(dá)下降。定量高分辨率染色體構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)顯示，與上游增強(qiáng)子簇的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用增強(qiáng)，與下游增強(qiáng)子簇的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用減弱。綜上所述，串聯(lián)反向的CTCF位點(diǎn)通過其絕緣子功能維持上下游增強(qiáng)子簇對(duì)基因簇表達(dá)調(diào)控的平衡，為探究動(dòng)物發(fā)育過程中基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制提供參考。

基因簇；CTCF位點(diǎn)；調(diào)控平衡；增強(qiáng)子；絕緣子

染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF(CCCTC-binding factor)是一類結(jié)合DNA的鋅指蛋白，在哺乳動(dòng)物中可與基因組上調(diào)控區(qū)域內(nèi)大量的絕緣子結(jié)合，對(duì)發(fā)育基因的精準(zhǔn)調(diào)控起到關(guān)鍵作用[1～6]。CTCF最初在雞中被發(fā)現(xiàn)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子或共抑制因子[7]，CTCF結(jié)合位點(diǎn)(CTCF-binding site，CBS)序列在脊椎動(dòng)物中高度保守，超過30多萬的CBS廣泛分布在整個(gè)基因組中[8]。CTCF與cohesin復(fù)合物通過環(huán)擠出模型(loop extrusion model)共同介導(dǎo)遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，參與基因的調(diào)控[3,9,10]。CBS序列的方向性直接影響染色質(zhì)遠(yuǎn)距離互作，分別被正向和反向CBS元件錨定的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子在CTCF/cohesin介導(dǎo)下形成遠(yuǎn)距離染色質(zhì)環(huán)[2,3,5,11～14]。成對(duì)的反向–正向CBS (背靠背)通常分布在拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域(topological- associated domain, TAD)邊界，發(fā)揮絕緣子的作用，阻止增強(qiáng)子跨區(qū)域異位激活基因表達(dá)[3]。CTCF除了能與cohesin一起介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)，還能與其他的非編碼調(diào)控元件及架構(gòu)蛋白(如YY1)共同搭建三維基因組結(jié)構(gòu)[1,15,16]。CTCF參與調(diào)控的染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)是生物體發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)，包括神經(jīng)系統(tǒng)中原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇啟動(dòng)子的選擇[4,13,14,17]、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1 (UDP-glucuronosyltransferase 1,)的表達(dá)[12]、免疫球蛋白(Immunoglobulin,)和T細(xì)胞受體(T cell receptor,)的V(D)J重組[18～20]、四肢發(fā)育過程中的同源框基因家族(homeobox gene family,)控制[21～23]以及生物學(xué)的其他方面[1,24]。

脊椎動(dòng)物和果蠅基因簇內(nèi)的CTCF結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)過數(shù)億年進(jìn)化仍然存在，這暗示了在兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物進(jìn)化歷程中CTCF參與基因表達(dá)調(diào)控的古老起源[25]?；虼鼐幋a的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著細(xì)胞分化的多個(gè)方面，影響生物體四肢發(fā)育、器官形成等[26]。在哺乳動(dòng)物中，基因分布在四個(gè)簇中，分別命名為、、和，根據(jù)序列同源性及在簇中的位置，基因分為13組(～) (圖1A)，軀干和四肢的不同區(qū)域表達(dá)基因的不同組合[27]。在發(fā)育的最初階段，基因簇不表達(dá)，在發(fā)育過程中主要沿胚胎首尾軸(head-to-tail axis)呈時(shí)空線性表達(dá)[28]。

基因簇包括、、、～，整體位于兩個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域邊界，受上游增強(qiáng)子簇(upstream enhancer cluster)和下游增強(qiáng)子簇(downstream enhancer cluster)調(diào)控(圖1，A和B)。在小鼠胚胎肢芽(limb bud)發(fā)育早期，位于基因簇3′端粒側(cè)TAD(telomeric domain, T-DOM)處于激活狀態(tài)，控制～在四肢的近端轉(zhuǎn)錄[29]；隨后，在胚胎肢芽(limb bud)遠(yuǎn)端細(xì)胞中，位于5′中心粒側(cè)TAD (centromeric domain, C-DOM)處于激活狀態(tài)，負(fù)責(zé)～在手指細(xì)胞中的表達(dá)[30,31]。在小鼠胚胎肢芽中，上游增強(qiáng)子簇中的5個(gè)增強(qiáng)子(Island1～5)包含許多保守的非編碼調(diào)控元件，同時(shí)富集有H3K4me1、H3K27ac(活性增強(qiáng)子標(biāo)記)，與～有很強(qiáng)的互作[31]。刪除部分增強(qiáng)子只會(huì)影響它們與～基因的互作，但對(duì)～基因的表達(dá)影響不大；當(dāng)完全刪除上游增強(qiáng)子簇，～基因表達(dá)才會(huì)完全消失。這些研究表明這些Island之間可能存在冗余性和互補(bǔ)性[31]。在小鼠生殖器結(jié)節(jié)(genital tubercle，GT)中，上游增強(qiáng)子簇中的GT1和GT2與啟動(dòng)子也有遠(yuǎn)距離DNA相互作用，但GT2僅在生殖器中表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，在肢端細(xì)胞中不能顯著激活基因轉(zhuǎn)錄[32]。在小鼠肢芽近端細(xì)胞中，下游增強(qiáng)子簇中的CS38-41 (conserved sequence element 38-41)參與調(diào)控～的表達(dá)[21]。這些上下游增強(qiáng)子簇通過轉(zhuǎn)錄因子或架構(gòu)蛋白介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)與基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程互作，從而完成特定的基因調(diào)控[33～35]。然而，目前對(duì)于基因簇調(diào)控機(jī)制的研究主要借助于在小鼠中對(duì)其調(diào)控區(qū)域或者基因進(jìn)行大片段刪除或反轉(zhuǎn)[21,22,31,32,36]，對(duì)于人細(xì)胞中基因簇調(diào)控機(jī)制的研究較少。

本研究以人基因簇為模式基因，探索CTCF對(duì)發(fā)育基因(developmental genes)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。利用CRISPR DNA片段編輯系統(tǒng)[37～40]在人HEK293T細(xì)胞中獲得一系列的串聯(lián)反向CBS刪除的單細(xì)胞克隆株。進(jìn)行RNA-seq實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CBS刪除后基因表達(dá)水平的變化，最后通過定量高分辨率染色體構(gòu)象捕獲(quantitative high resolution ch-romosome conformation capture copy, QHR-4C)[13]進(jìn)一步觀測(cè)CBS刪除對(duì)基因簇三維基因組結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)成串反向排列的CTCF位點(diǎn)具有平衡上下游增強(qiáng)子簇對(duì)基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，為揭示哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T從中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自南美ExCell公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1-Cas9-WT質(zhì)粒來源于北京大學(xué)席建忠教授；Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶、RNA文庫制備試劑盒、Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix均從美國NEB公司采購；pGL3-U6-sgRNA-Puromycin- BsaⅠ質(zhì)粒由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授贈(zèng)予；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均從美國AXYGEN公司采購；MinElute Gel Extraction kit從德國QIAGEN公司采購；Green Taq Mix、dNTPs、高保真Phanta DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pClone007 Versatile Simple Vector購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；sgRNA、測(cè)序引物由上海生物工程(上海)股份有限公司合成；Triton X-100、10%SDS、DNA提取液、NP40等從美國SIGMA公司采購；三氯甲烷、硼酸和乙醇購自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；異丙醇和氯化鈉購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鏈霉親和素磁珠從美國Invitrogen公司采購；PCR文庫純化試劑盒從瑞士Roche公司采購；甲醛溶液、RNA酶A、糖原等均從美國Thermo公司采購；TRIzol Reagent從美國Ambion公司采購；AMPure XP Beads從美國BeckmanCoulter公司采購；CTCF抗體從英國Abcam公司采購。

圖1 CTCF位點(diǎn)在Hox基因簇及其調(diào)控區(qū)域內(nèi)的分布

A：果蠅及哺乳動(dòng)物基因家族的基因組結(jié)構(gòu)。果蠅基因簇分為觸足復(fù)合群(ANT-C)和雙胸復(fù)合群(BX-C)，其中ANT-C包含、、、和基因，BX-C包含、和基因。哺乳動(dòng)物具有4個(gè)基因簇：、、和，共包含39個(gè)基因，其中基因簇包括、、、～。果蠅及哺乳動(dòng)物相同顏色的基因?yàn)橹毕低椿?orthologues)，它們起源于同一祖先基因。B：人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T中的CTCF蛋白、架構(gòu)蛋白YY1、增強(qiáng)子標(biāo)記H3K4me1和H3K27ac、啟動(dòng)子標(biāo)記H3K4me3、轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記PolⅡ和p300在人基因簇及其調(diào)控區(qū)域內(nèi)的分布。紅色虛線框指示增強(qiáng)子Island2、Island5、GT2、CS38-41和基因簇所在區(qū)域。哺乳動(dòng)物的基因簇位于3′端粒側(cè)TAD (T-DOM)和5′中心粒側(cè)TAD (C-DOM)交界處，并受到上下游增強(qiáng)子簇(upstream enhancer cluster和downstream enhancer cluster)的調(diào)控。C：人類基因簇區(qū)域CTCF位點(diǎn)的分布。人腎臟和胚胎腎細(xì)胞系HEK293T的CTCF ChIP-seq結(jié)合峰分布圖：基因簇C-DOM和T-DOM交界區(qū)域均具有串聯(lián)排列的CTCF位點(diǎn)。紅色虛線框依次指示CBS a、b、c和e所在區(qū)域。D：小鼠基因簇區(qū)域CTCF位點(diǎn)的分布。小鼠腎臟和第12.5天胚胎肢芽CTCF ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示小鼠基因簇中心粒側(cè)對(duì)應(yīng)的位置具有串聯(lián)反向排列的4個(gè)CTCF位點(diǎn)。圖C和D中箭頭代表CTCF位點(diǎn)，其中紅色箭頭代表正向CTCF位點(diǎn)，藍(lán)色箭頭代表反向CTCF位點(diǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)基為89% DMEM完全培養(yǎng)液、10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的混合液，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 HEK293T細(xì)胞CTCF的ChIP-seq

收集2×107細(xì)胞后，首先用1%甲醛交聯(lián)細(xì)胞，再加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸溶液終止反應(yīng)，然后用預(yù)冷的ChIP緩沖液裂解細(xì)胞兩次(裂解條件均為4℃，緩慢旋轉(zhuǎn)10 min)，離心后再用預(yù)冷的ChIP緩沖液重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min。用非接觸式超聲儀進(jìn)行超聲，凝膠電泳鑒定超聲后DNA片段長度為100～10,000 bp。將細(xì)胞懸液離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中并加入50 μL的protein A/G磁珠孵育2 h。用磁力架棄去磁珠，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中加入4 μg的CTCF抗體，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜。第二天加入50 μL的protein A/G磁珠，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育3 h。然后用ChIP緩沖液、高鹽緩沖液、無鹽緩沖液、LiCl緩沖液清洗磁珠(每次4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育10 min)，最后用洗脫緩沖液洗脫DNA。含有DNA的溶液經(jīng)過RNA酶A (37℃震蕩孵育2 h)、蛋白酶K (55℃靜置孵育2 h)及酚氯仿試劑純化后，DNA沉淀用無核酸酶的水溶解，最后用諾唯贊公司的ChIP-seq試劑盒ND607-02構(gòu)建DNA文庫。文庫通過蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)index序列(P7-index序列見表1)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，通過Bowtie2比對(duì)到GRCh37/hg19基因組，用BamCoverage進(jìn)行歸一化處理，標(biāo)準(zhǔn)化到RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)，共做兩個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品文庫測(cè)序約2000萬條序列。

續(xù)表

sgRNA引物中帶下劃線部分為構(gòu)建質(zhì)粒所需的粘性末端。P7-index中粗體帶下劃線部分為index。

1.4 HEK293T細(xì)胞中組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)志及CTCF的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析

人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T的H3K4me1和H3K27ac ChIP-seq數(shù)據(jù)來源于ENCODE數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)編號(hào)分別為ENCSR000FCG和ENCSR000FCH；YY1、H3K4me3、PolⅡ、p300來源于GEO，數(shù)據(jù)編號(hào)分別為GSM3636215、GSM945288、GSM935534、GSM1239071；人腎臟CTCF ChIP-seq數(shù)據(jù)的GEO編號(hào)為GSM1006886；小鼠腎臟及第12.5天胚胎肢芽CTCF ChIP-seq數(shù)據(jù)的GEO編號(hào)分別為GSE91529、GSM4665698；將數(shù)據(jù)分別比對(duì)到GRCh37/hg19及GRCm38/mm10基因組進(jìn)行分析。

1.5 構(gòu)建pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒

按照表1合成單鏈sgRNA (共10條，分別合成雙鏈sgRNA a1、sgRNA b1、sgRNA c1、sgRNA e1和sgRNA e2)，按照如下體系(總體積為20 μL，)進(jìn)行退火步驟：2 μL sgRNA-F，2 μL sgRNA-R，2 μL 10 × NEB Buffer 2，14 μL ddH2O；退火條件：95℃預(yù)變性5 min，緩慢降溫(從第二個(gè)循環(huán)開始，每個(gè)循環(huán)20 s、降溫0.2℃，共351個(gè)循環(huán))。環(huán)狀pGL3- U6-sgRNA-Puromycin-BsaⅠ質(zhì)粒經(jīng)過Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶處理后，得到線性的pGL3-U6-sgRNA- Puromycin載體。將退火后的雙鏈sgRNA引物與線性化的pGL3-U6-sgRNA-Puromycin載體在室溫進(jìn)行連接，經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)(每種sgRNA至少挑取3個(gè)單菌落)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒純化質(zhì)粒并測(cè)序。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與單克隆化

待12孔板內(nèi)的HEK293T細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～ 90%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，一個(gè)離心管中加入Lipofec-tamine 3000與MEM混合均勻室溫靜置5 min，另一個(gè)管中加入Cas9質(zhì)粒、兩種sgRNA質(zhì)粒、p3000試劑和MEM培養(yǎng)基混合均勻后室溫靜置5 min (此步驟中sgRNA組合：sgRNA a1/sgRNA e2或sgRNA b1/sgRNA e2或sgRNA c1/sgRNA e2或sgRNA e1/sgRNA e2)，然后將Lipofectamine 3000加入其中，混合均勻后室溫孵育約15 min，滴入培養(yǎng)細(xì)胞中。

待轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)到48 h后，換用含有2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選。藥物篩選大約4天后，更換為DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天，然后用胰酶消化收集適量細(xì)胞至PCR管中，加入10 μL堿裂解液，混勻置于PCR儀中，98℃ 30 min使細(xì)胞裂解，再加入10 μL中和液，獲得細(xì)胞基因組。在sgRNA上下游位置設(shè)計(jì)PCR引物，鑒定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中是否含有目的片段刪除的細(xì)胞，若存在，則對(duì)12孔板中剩余的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋至濃度約為1個(gè)細(xì)胞每100 μL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長一周左右，顯微鏡下查看單一細(xì)胞團(tuán)并做好標(biāo)記。sgRNA和PCR引物序列見表1。

1.7 單細(xì)胞克隆株鑒定

將標(biāo)記的單細(xì)胞克隆株(共1056個(gè))用胰酶消化，轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞到含有10 μL堿裂解液的PCR小管中進(jìn)行裂解反應(yīng)獲取細(xì)胞基因組。兩個(gè)sgRNA對(duì)大片段DNA進(jìn)行刪除時(shí)，會(huì)造成兩個(gè)切口，需要通過特異性引物鑒定排除片段反轉(zhuǎn)的情況[37,41]。通過PCR反應(yīng)(PCR引物序列見表1)及DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)挑選出目的片段刪除的純合子單細(xì)胞克隆株，將細(xì)胞目的片段刪除型的擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳分離，切膠回收并送測(cè)。若測(cè)序結(jié)果為雙峰，則需要進(jìn)行TA克隆測(cè)序鑒定單細(xì)胞克隆株的基因型。

按照TA克隆產(chǎn)品推薦用量將PCR產(chǎn)物與pClone007 Versatile Simple Vector混合均勻，室溫孵育約10 min；在離心管中將連接產(chǎn)物與50 μL感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰上靜置30 min后，進(jìn)行42℃熱激45 s，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰上，2 min后加入500 μL的LB無抗培養(yǎng)基，然后將離心管放在37℃搖床上培養(yǎng)1 h。離心后去除450 μL上清，重懸細(xì)胞后均勻涂布在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)約16 h，次日挑取8～10個(gè)單菌落測(cè)序，然后將桑格測(cè)序結(jié)果與目的片段序列比對(duì)，確定單細(xì)胞克隆株基因型。最終獲得CBS e刪除、CBS c-e刪除、CBS b-e刪除和CBS a-e刪除的單細(xì)胞克隆株各兩株。

1.8 RNA-seq實(shí)驗(yàn)

待12孔板中處于對(duì)數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞、單細(xì)胞克隆株匯合度達(dá)到90%時(shí)，先用1 × PBS清洗2遍，然后加入500 μL/孔TRIzol溶液處理15 min，然后轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管中，用三氯甲烷、異丙醇、乙醇提取純化總RNA。根據(jù)試劑說明書進(jìn)行如下操作：使用Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module試劑盒提取mRNA，利用磁珠對(duì)mRNA片段進(jìn)行分離與片段化；通過PCR反應(yīng)先進(jìn)行cDNA第一鏈合成，再進(jìn)行cDNA第二鏈合成反應(yīng)；雙鏈cDNA連接Adaptor之后，用AMPure XP Beads和新鮮配制的80%的乙醇對(duì)DNA進(jìn)行純化，進(jìn)行文庫擴(kuò)增反應(yīng)；擴(kuò)增后產(chǎn)物用AMPure XP Beads和新鮮配制的80%的乙醇進(jìn)行純化，最后用無核酸酶的水洗脫DNA文庫。用Qubit3 Fluorometer測(cè)量終產(chǎn)物濃度后送至蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)特異性index序列(表1)拆分?jǐn)?shù)據(jù)，用STAR、cufflinks等軟件分析數(shù)據(jù)[42]。本研究共有30個(gè)RNA-seq樣品，每個(gè)樣品文庫測(cè)序約1000萬條序列。

1.9 定量高分辨率染色體構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)QHR-4C

用10 cm培養(yǎng)皿擴(kuò)增培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞、單細(xì)胞克隆株，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%且生長良好時(shí)，用胰酶消化離心收集細(xì)胞；用1%甲醛交聯(lián)細(xì)胞，再加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸溶液終止反應(yīng)；用預(yù)冷的1 × PBS重復(fù)清洗細(xì)胞，然后配制4C裂解液(1 × inhibitor、pH 7.5 50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.5% NP-40和1% Triton X-100)重復(fù)裂解細(xì)胞；通過Triton X-100、Ⅱ限制性內(nèi)切酶處理使DNA片段化，用T4 DNA連接酶捕捉相互鄰近的DNA片段；純化連接后的DNA，然后進(jìn)行超聲處理(不同長度的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定呈彌散狀分布且主要片段長度小于1000 bp)、PCR線性擴(kuò)增反應(yīng)及接頭連接反應(yīng)，最后進(jìn)行DNA文庫擴(kuò)增。文庫送至蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)index(序列見表1)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拆分，通過Bowtie2、Samtools、r3C-seq等方法處理數(shù)據(jù)[13]。本研究每個(gè)實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)，共有78個(gè)4C樣品，每個(gè)樣品文庫測(cè)序約800萬條序列。

1.10 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)信息

本研究的相關(guān)結(jié)果數(shù)據(jù)已收錄在國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)(CNGBdb)[43]的國家基因庫序列歸檔系統(tǒng)(CNSA)[44]，項(xiàng)目編號(hào)：CNP0001773。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTCF位點(diǎn)在HOXD基因簇的分布高度保守

基因簇最初因引起黑腹果蠅翅膀數(shù)目改變而被發(fā)現(xiàn)，在兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物中高度保守[45]。果蠅基因組中含有一個(gè)基因簇，由8個(gè)基因組成，分為觸足復(fù)合群(ANT-C)和雙胸復(fù)合群(BX-C)，其中ANT-C包含、、、和基因，BX-C包含、和基因(圖1A)。而哺乳動(dòng)物基因組具有四個(gè)基因簇：、、和，共包括39個(gè)基因[27](圖1A)，這可能是由進(jìn)化過程中的兩次DNA片段復(fù)制過程產(chǎn)生[46,47]。本研究以人HEK293T細(xì)胞為模型，通過分析ChIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)位于C-DOM和T-DOM邊界的基因簇串聯(lián)排列著多個(gè)CTCF位點(diǎn)，提示CTCF可能對(duì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用(圖1B)。

利用ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析了與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和各組蛋白修飾在基因簇及其兩側(cè)調(diào)控區(qū)域內(nèi)富集的情況，包括CTCF蛋白、架構(gòu)蛋白YY1、增強(qiáng)子標(biāo)記H3K4me1、H3K27ac，啟動(dòng)子標(biāo)記H3K4me3，轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記PolⅡ、p300(圖1B)：基因簇所在的區(qū)域有大量的CTCF蛋白、YY1蛋白富集以及H3K27ac、H3K4me3組蛋白修飾，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域；Island2、Island5處有CTCF蛋白結(jié)合峰，但是沒有相應(yīng)的組蛋白修飾，也沒有轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記(PolⅡ和p300)，提示Island2、Island5在HEK293T細(xì)胞中可能沒有增強(qiáng)子活性。GT2處沒有CTCF蛋白結(jié)合，有YY1的結(jié)合峰、H3K4me1和H3K27ac等組蛋白修飾(圖1B)，說明在HEK293T中增強(qiáng)子GT2可能不完全依賴CTCF激活基因轉(zhuǎn)錄；CS38-41處有CTCF、YY1結(jié)合以及H3K27ac組蛋白修飾，同時(shí)富集PolⅡ和p300，因此在HEK293T細(xì)胞中具有較強(qiáng)的增強(qiáng)子活性。

為了分析基因簇處CTCF分布的保守性，本研究比較了人腎臟和人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T中CTCF的ChIP-seq結(jié)合峰分布，發(fā)現(xiàn)基因簇C-DOM和T-DOM交界區(qū)域均分布著成簇排列的CBS，靠近C-DOM處具有5個(gè)串聯(lián)排列的反向CBS，分別記為CBS a、b、c、d和e(圖1C)。此外，分析小鼠腎臟及第12.5天胚胎肢芽CTCF的ChIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，小鼠基因簇中心粒側(cè)對(duì)應(yīng)的位置串聯(lián)排列著類似的CBS簇(圖1D)。綜上所述，C-DOM和T-DOM邊界處串聯(lián)排列的反向CBS簇在哺乳動(dòng)物中高度保守，CTCF可能通過結(jié)合該CBS簇參與指導(dǎo)兩側(cè)調(diào)控區(qū)域內(nèi)的增強(qiáng)子對(duì)基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。

2.2 邊界處單個(gè)CTCF位點(diǎn)刪除影響HOXD基因簇表達(dá)

為了研究反向串聯(lián)排列的CBS a、b、c、d和e對(duì)人基因簇調(diào)控的作用，首先用CRISPR/ Cas9編輯技術(shù)對(duì)CBS e進(jìn)行刪除。我們針對(duì)CBS e設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA (sgRNA e1和sgRNA e2)，Cas9核酸酶在sgRNA介導(dǎo)下特異性識(shí)別CBS e兩側(cè)靶向序列后進(jìn)行切割，經(jīng)過修復(fù)后能夠獲得CBS e刪除的編輯細(xì)胞(圖2A)。利用PCR篩選單細(xì)胞克隆株(圖2B)，對(duì)獲得的單細(xì)胞克隆株進(jìn)行TA克隆并測(cè)序確定其基因型(圖2C)。獲得的e#113存在兩種不同的染色體基因型，Allele 1是853 bp片段刪除的基因型，其切口連接處有小片段DNA刪除，Allele 2是Cas9蛋白在PAM位點(diǎn)上游第3位切割后精確DNA修復(fù)產(chǎn)生的831 bp片段刪除的基因型[41,48,49]；e#126也存在兩種不同的染色體基因型，其中一種是Cas9蛋白精準(zhǔn)切割在PAM位點(diǎn)上游第3位后修復(fù)，另一種可能是Cas9蛋白切割在PAM位點(diǎn)上游第3位和第4位[48]：基因型鑒定及測(cè)序結(jié)果均證明e#113和e#126細(xì)胞中CBS e已被刪除(圖2C)。

圖2 CBS e刪除改變?cè)鰪?qiáng)子與啟動(dòng)子間的遠(yuǎn)程互作從而影響HOXD基因簇的基因表達(dá)

A：利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)獲得CBS e刪除的單細(xì)胞克隆株(e#113和e#126)的示意圖。針對(duì)CBS e設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(sgRNA e1和sgRNA e2)，Cas9核酸酶在sgRNA e1和sgRNA e2的介導(dǎo)下特異性識(shí)別CBS e兩側(cè)靶向序列后進(jìn)行切割，形成的兩個(gè)切口被修復(fù)后連接在一起獲得CBS e刪除的編輯細(xì)胞。B：采用特異性引物PCR后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)鑒定單細(xì)胞克隆株。引物對(duì)e1F/e2R在野生型(WT)細(xì)胞中擴(kuò)增出1560 bp的片段，在e#113和e#126細(xì)胞株中擴(kuò)增出CBS e刪除后的729 bp片段(紅色虛線框指示目的條帶)。C：TA克隆并進(jìn)行桑格測(cè)序確定單細(xì)胞克隆株的基因型。引物對(duì)e1F/e2R在e#113和e#126細(xì)胞株中擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后的測(cè)序結(jié)果圖。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT細(xì)胞、e#113和e#126細(xì)胞株中基因簇表達(dá)水平。*：<0.05；**：<0.01；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped reads。E：在染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(QHR-4C)實(shí)驗(yàn)中，以增強(qiáng)子Island5為觀測(cè)點(diǎn)(viewpoint，VP)，分析e#113和e#126細(xì)胞株中Island5與基因簇啟動(dòng)子及調(diào)控元件Island2、GT2和CS38-41的遠(yuǎn)程互作。將e#113和e#126細(xì)胞株的數(shù)據(jù)分別與WT進(jìn)行l(wèi)og2處理，紅色實(shí)線框內(nèi)為Island5與基因簇啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、GT2和CS38-41。F：以增強(qiáng)子GT2為VP，分析CBS e刪除后GT2與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作。紅色實(shí)線框內(nèi)為GT2與基因簇啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、Island5和CS38-41。G：以啟動(dòng)子為VP，分析e#113和e#126細(xì)胞株中調(diào)控元件Island2、Island5、GT2、CS38-41與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用。黑色虛線框指示Island2，紅色實(shí)線框內(nèi)分別為Island5、GT2和CS38-41與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖。

為了研究單個(gè)CBS e刪除是否會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)獲得的單細(xì)胞克隆株進(jìn)行RNA-seq實(shí)驗(yàn)。在HEK293T細(xì)胞中，～以及表達(dá)量較高；CBS e刪除后及的表達(dá)水平降低最顯著(圖2D)。為了探究CBS e刪除對(duì)基因表達(dá)影響的機(jī)制，對(duì)獲得的e#113和e#126單細(xì)胞克隆株進(jìn)行QHR-4C實(shí)驗(yàn)，分別以Island5、GT2及為觀測(cè)點(diǎn)，分析CBS e刪除后細(xì)胞內(nèi)基因簇染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變化。在WT細(xì)胞中，增強(qiáng)子Island5、GT2與基因簇之間存在顯著的DNA相互作用(圖2，E和F)，啟動(dòng)子主要與下游增強(qiáng)子簇中的CS38-41有遠(yuǎn)距離DNA相互作用(圖2G)。刪除CBS e后～啟動(dòng)子與Island5之間相互作用有顯著增加(圖2E)。除了與，其余基因啟動(dòng)子與GT2的相互作用略微增加(圖2F)。啟動(dòng)子與Island5、GT2的遠(yuǎn)程互作有明顯增加，與前述結(jié)果一致，其與CS38-41的相互作用略微減少(圖2G)。綜上所述，單個(gè)CBS e刪除引起基因簇啟動(dòng)子與增強(qiáng)子之間的遠(yuǎn)距離DNA相互作用改變，導(dǎo)致及表達(dá)水平降低。

2.3 邊界處多個(gè)CTCF位點(diǎn)刪除對(duì)HOXD基因簇遠(yuǎn)距離DNA相互作用的影響具有疊加效應(yīng)

為了探究多個(gè)CBS刪除對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們對(duì)CBS c-e (圖3)和CBS b-e (圖4)進(jìn)行刪除。分別設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA (sgRNA c1/sgRNA e2和sgRNA b1/sgRNA e2)對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行編輯(圖3A和圖4A)，再用特異性引物PCR進(jìn)行凝膠電泳鑒定(圖3B和圖4B)。將目的條帶切膠純化、TA克隆并進(jìn)行桑格測(cè)序鑒定細(xì)胞的基因型，最終獲得了CBS c-e刪除的c-e#49和c-e#54單細(xì)胞克隆株(圖3C)以及CBS b-e刪除的b-e#59和b-e#80單細(xì)胞克隆株(圖4C)。

通過RNA-seq實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CBS c-e和CBS b-e刪除的細(xì)胞(這些細(xì)胞的已刪除)中，、及的轉(zhuǎn)錄水平下降，其中下降最顯著；的轉(zhuǎn)錄水平分別降低了約40%和56%(圖3D和圖4D)。QHR-4C實(shí)驗(yàn)顯示，無論在CBS c-e還是CBS b-e刪除的細(xì)胞中，～與Island5之間的遠(yuǎn)程互作均增加(圖3E和圖4E)，與GT2的互作也增加，且幅度比CBS e單獨(dú)刪除型細(xì)胞大(圖3F和圖4F)。在CBS b-e刪除的細(xì)胞中，啟動(dòng)子與增強(qiáng)子Island5及GT2的遠(yuǎn)程互作相對(duì)CBS c-e刪除型細(xì)胞進(jìn)一步增強(qiáng)(圖3G和圖4G)，并且在Island5介導(dǎo)的遠(yuǎn)程互作中新增了下游增強(qiáng)子簇(CS38-41)(圖3E和圖4E)；啟動(dòng)子與CS38-41之間的相互作用沒有進(jìn)一步減弱(圖3G和圖4G)。綜上所述，邊界處CBS刪除的數(shù)量對(duì)上游增強(qiáng)子簇與基因簇遠(yuǎn)程互作的影響有疊加效應(yīng)，但不會(huì)遞進(jìn)式地影響整個(gè)基因(除了)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

2.4 邊界處CTCF位點(diǎn)的全部刪除破壞了增強(qiáng)子調(diào)控HOXD基因簇表達(dá)的平衡

CTCF常富集于TAD區(qū)域邊界，對(duì)維持相關(guān)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定具有重要作用。為了探究整個(gè)CBS a-e對(duì)基因簇表達(dá)調(diào)控的影響，設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(sgRNA a1和sgRNA e2)將CBS a-e刪除(圖5A)，進(jìn)行PCR鑒定(圖5B)、TA克隆并進(jìn)行桑格測(cè)序(圖5C)獲得a-e#93和a-e#108單細(xì)胞克隆株。對(duì)CBS a-e刪除的細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，、與的基因表達(dá)顯著降低，其中最顯著，降低了約70% (圖5D)。QHR-4C實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Island5與下游增強(qiáng)子簇(CS38-41)的互作進(jìn)一步增加，原本與CBS a-e整體的互作進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至下游的一個(gè)反向CBS附近，從而使其與基因簇內(nèi)啟動(dòng)子的互作從～擴(kuò)展至～(圖5E)；GT2與～啟動(dòng)子的互作增強(qiáng)，同時(shí)與T-DOM的染色質(zhì)遠(yuǎn)距離互作增強(qiáng)(圖5F)。以Island5、GT2為觀測(cè)點(diǎn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)有意思的現(xiàn)象：有CTCF結(jié)合的Island5與基因簇的染色質(zhì)相互作用區(qū)域具有明顯的邊界(圖2E、3E、4E和5E)，而沒有CTCF結(jié)合的增強(qiáng)子GT2與基因簇區(qū)域的染色質(zhì)相互作用呈現(xiàn)廣泛彌散式分布(圖2F、3F、4F和5F)，沒有明顯的邊界，這提示具有CTCF結(jié)合的調(diào)控元件以及沒有CTCF結(jié)合的調(diào)控元件與基因啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用模式是不同的。以啟動(dòng)子為VP發(fā)現(xiàn)，在HEK293T野生型細(xì)胞中，啟動(dòng)子主要與下游增強(qiáng)子簇有DNA相互作用；而在CBS a-e刪除的細(xì)胞中，啟動(dòng)子與上游增強(qiáng)子簇(Island2、Island5、GT2、GCR和Prox)的遠(yuǎn)程互作普遍顯著增強(qiáng)，與下游增強(qiáng)子簇(CS38-41)的遠(yuǎn)程互作普遍減弱，CBS a-e刪除改變了的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，由最初主要受下游增強(qiáng)子簇調(diào)控轉(zhuǎn)變?yōu)樯舷掠蝺蓚€(gè)增強(qiáng)子簇調(diào)控(圖5G)，原有的調(diào)控平衡被破壞，這可能是導(dǎo)致～轉(zhuǎn)錄水平急劇降低的原因。

圖3 CBS c-e刪除引起上游增強(qiáng)子與近端HOXD基因相互作用的增強(qiáng)

A：設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(sgRNA c1和sgRNA e2)對(duì)HEK293T野生型細(xì)胞進(jìn)行編輯獲得CBS c-e刪除的單細(xì)胞克隆株(c-e#49和c-e#54)的示意圖。B：用引物c1F和e2R PCR鑒定c-e#49和c-e#54單細(xì)胞克隆株的凝膠電泳圖。C：TA克隆鑒定c-e#49和c-e#54單細(xì)胞克隆株基因型的測(cè)序結(jié)果圖。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT細(xì)胞、c-e#49和c-e#54細(xì)胞中基因簇表達(dá)水平。E：QHR-4C實(shí)驗(yàn)中，以Island5為VP，分析c-e#49和c-e#54細(xì)胞株中Island5與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作。紅色實(shí)線框內(nèi)為Island5與基因簇啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、GT2和CS38-41。F：以GT2為VP，分析CBS c- e刪除后GT2與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作。紅色實(shí)線框內(nèi)為GT2與基因簇啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、Island5和CS38-41。G：以啟動(dòng)子為VP，c-e#49和c-e#54細(xì)胞株中Island2、Island5、GT2、CS38-41與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用。黑色虛線框指示Island2，紅色實(shí)線框內(nèi)分別為Island5、GT2和CS38-41與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖。

圖4 串聯(lián)排列CTCF位點(diǎn)對(duì)增強(qiáng)子遠(yuǎn)程互作和HOXD基因表達(dá)具有疊加效應(yīng)

A：利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)獲得CBS b-e刪除的單細(xì)胞克隆株(b-e#59和b-e#80)的示意圖。B：用引物b1F和e2R1進(jìn)行PCR鑒定b-e#59和b-e#80單細(xì)胞克隆株的凝膠電泳圖。C：TA克隆鑒定b-e#59和b-e#80單細(xì)胞克隆株基因型的測(cè)序結(jié)果圖。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT細(xì)胞、b-e#59和b-e#80細(xì)胞株細(xì)胞中基因簇表達(dá)水平。E：QHR-4C實(shí)驗(yàn)中，以Island5為VP，分析CBS b-e刪除對(duì)Island5與基因簇啟動(dòng)子遠(yuǎn)程互作的影響。紅色實(shí)線框內(nèi)為Island5與基因簇啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、GT2和CS38-41。F：以GT2為VP，分析b-e#59和b-e#80細(xì)胞株中GT2與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作。紅色實(shí)線框內(nèi)為GT2與基因簇啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、Island5和CS38-41。G：以啟動(dòng)子為VP，分析b-e#59和b-e#80細(xì)胞株中Island5、GT2、CS38-41與啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用。黑色虛線框指示Island2，紅色實(shí)線框內(nèi)分別為Island5、GT2和CS38-41與啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖。

以上結(jié)果說明，C-DOM和T-DOM邊界處的反向串聯(lián)排列的CBS主要調(diào)控～及的基因表達(dá)。在HEK293T細(xì)胞中，Island2、Island5沒有增強(qiáng)子活性，GT2不完全依賴于CTCF調(diào)控的表達(dá)，上游增強(qiáng)子簇與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作增加，削弱了下游增強(qiáng)子簇中的CS38-41對(duì)基因簇的激活強(qiáng)度。邊界處單個(gè)CBS刪除就會(huì)影響基因簇原有的三維基因組結(jié)構(gòu)，改變和的基因表達(dá)。多個(gè)CBS刪除對(duì)基因簇三維基因組結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄的影響具有疊加效應(yīng)，但是沒有大幅度改變其他基因的表達(dá)。當(dāng)邊界處整個(gè)CBS a-e全部刪除后，基因簇與CS38-41的染色質(zhì)相互作用進(jìn)一步減弱，轉(zhuǎn)錄水平急劇降低，并且上下游增強(qiáng)子簇之間出現(xiàn)了遠(yuǎn)距離相互作用。綜上所述，基因簇靠近中心粒側(cè)區(qū)域的反向串聯(lián)排列CTCF位點(diǎn)具有絕緣子功能，通過阻斷上游增強(qiáng)子簇與的染色質(zhì)遠(yuǎn)程互作，維持基因簇表達(dá)調(diào)控的平衡，使基因能夠精準(zhǔn)有序地表達(dá)。

圖5 刪除全部反向CTCT位點(diǎn)破壞增強(qiáng)子調(diào)控HOXD基因表達(dá)的平衡

A：獲得CBS a-e刪除的單細(xì)胞克隆株(a-e#93和a-e#108)的示意圖。B：用引物a1F和e2R PCR鑒定a-e#93和a-e#108細(xì)胞株的凝膠電泳圖。C：TA克隆鑒定a-e#93和a-e#108單細(xì)胞克隆株基因型的測(cè)序結(jié)果圖。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT細(xì)胞、a-e#93和a-e#108細(xì)胞株細(xì)胞中基因簇轉(zhuǎn)錄水平。E：QHR-4C實(shí)驗(yàn)中，以Island5為VP，分析CBS a-e刪除對(duì)Island5與基因簇啟動(dòng)子及兩側(cè)調(diào)控區(qū)域染色質(zhì)相互作用的影響。紅色實(shí)線框內(nèi)為Island5與基因簇啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、GT2和CS38-41。F：以GT2為VP，分析a-e#93和a-e#108細(xì)胞株中GT2與基因簇啟動(dòng)子的染色質(zhì)相互作用。紅色實(shí)線框內(nèi)為GT2與基因簇啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用放大圖，黑色虛線框依次指示調(diào)控元件Island2、Island5和CS38-41。G：以啟動(dòng)子為VP，分析CBS a-e刪除后的表達(dá)調(diào)控模式。黑色虛線框指示Island2，紅色實(shí)線框內(nèi)為Island5、GT2、CS38-41與9基因簇啟動(dòng)子間的染色質(zhì)相互作用放大圖。

3 討論

在哺乳動(dòng)物中，增強(qiáng)子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過基因的數(shù)量，復(fù)雜基因的表達(dá)往往受多個(gè)增強(qiáng)子組合調(diào)控，防止在其適當(dāng)范圍之外的異位表達(dá)[50]。增強(qiáng)子活性的經(jīng)典模式是相對(duì)獨(dú)立的、自主的并且可疊加的，但是順式調(diào)控區(qū)域內(nèi)存在功能有冗余性(redundancy)的增強(qiáng)子[51,52]。增強(qiáng)子激活需要結(jié)合多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[53]，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合增強(qiáng)子后，對(duì)基因表達(dá)起抑制作用或激活作用取決于結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子[54]。例如，轉(zhuǎn)錄因子RFX5與增強(qiáng)子的結(jié)合對(duì)原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)起抑制作用[55]。增強(qiáng)子活性的強(qiáng)弱取決于招募的共激活蛋白對(duì)染色質(zhì)的修飾和增強(qiáng)子的重塑，包括組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(例如p300/CBP)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如MLL3/4和CARM1)、染色質(zhì)重塑因子(例如Brg1和CHD7)，以及在啟動(dòng)子處促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的相關(guān)因子(例如中介體復(fù)合物)[56]。本研究中，CBS a-e刪除后，基因簇與上游增強(qiáng)子簇中的Island5、GT2的遠(yuǎn)程互作顯著增加，而的表達(dá)下降，這表明Island5、GT2與啟動(dòng)子之間有互作，但是它們沒有增強(qiáng)子活性，這可能是因?yàn)樵谶@兩個(gè)增強(qiáng)子上結(jié)合了抑制性的共激活蛋白或轉(zhuǎn)錄因子[35,57]。小鼠胚胎發(fā)育過程中基因的表達(dá)就需要結(jié)合不同的轉(zhuǎn)錄因子[58]。

圖6 HOXD基因簇的表達(dá)調(diào)控模式圖

A：野生型(WT)細(xì)胞中基因簇的表達(dá)調(diào)控示意圖。在野生型細(xì)胞中，CTCF位點(diǎn)具有絕緣子作用，阻礙了上游增強(qiáng)子簇中的Island2、Island5、GT2與基因簇啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程相互作用，基因簇主要受下游增強(qiáng)子簇中的CS38-41調(diào)控。B：CTCF位點(diǎn)刪除的細(xì)胞中基因簇的表達(dá)調(diào)控示意圖。在CBS刪除的細(xì)胞中，CTCF位點(diǎn)絕緣子作用消失，上游增強(qiáng)子簇與基因簇之間產(chǎn)生遠(yuǎn)距離DNA相互作用，導(dǎo)致基因簇雙邊調(diào)控的平衡被破壞、基因表達(dá)降低。

CTCF與cohesin的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程[59]，成串的CBS可以阻礙滲透的cohesin滑動(dòng)，形成類似于“葫蘆”結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)環(huán)[1,17]，由此介導(dǎo)的遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的相互作用可有效持久地調(diào)控基因的表達(dá)。我們先前利用小鼠和多種細(xì)胞模型對(duì)原鈣粘蛋白和珠蛋白模式基因進(jìn)行系統(tǒng)的研究[13]，發(fā)現(xiàn)單個(gè)CTCF位點(diǎn)可確保適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)子絕緣和啟動(dòng)子激活，而串聯(lián)排列CTCF位點(diǎn)的絕緣作用可維持基因組三維空間的動(dòng)態(tài)平衡及準(zhǔn)確的啟動(dòng)子選擇。在本研究中，我們進(jìn)一步利用HEK293T細(xì)胞模型對(duì)基因簇中的CTCF位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的組合性刪除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)排列CTCF位點(diǎn)通過其絕緣功能維持上下游增強(qiáng)子簇調(diào)控基因表達(dá)的平衡。另外我們觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，包含CTCF位點(diǎn)的增強(qiáng)子Island5與基因的染色質(zhì)相互作用具有明顯的邊界，而不包含CTCF位點(diǎn)的增強(qiáng)子GT2與基因的染色質(zhì)相互作用區(qū)域則分布較廣泛，這和原鈣粘蛋白基因簇中的增強(qiáng)子HS5-1 (包含CTCF位點(diǎn))、HS7 (不包含CTCF位點(diǎn))與基因染色質(zhì)互作[13]的特點(diǎn)一致。

在本研究中，我們將基因簇C-DOM與T-DOM邊界處CTCF位點(diǎn)進(jìn)行逐步刪除，隨著剩余的CTCF位點(diǎn)數(shù)量減少，基因簇啟動(dòng)子與上游增強(qiáng)子簇DNA遠(yuǎn)程互作逐漸增強(qiáng)，與下游增強(qiáng)子簇的DNA遠(yuǎn)程互作逐漸減弱。當(dāng)邊界串聯(lián)反向的CTCF位點(diǎn)全部刪除后，基因啟動(dòng)子由最初與下游增強(qiáng)子簇有相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榕c上下游增強(qiáng)子簇均有相互作用，并且上下游增強(qiáng)子簇之間出現(xiàn)了DNA遠(yuǎn)程互作(圖6)。

綜上所述，基因簇中串聯(lián)反向CTCF位點(diǎn)扮演著絕緣子的角色，阻礙上游增強(qiáng)子簇跨區(qū)域調(diào)控近端基因的表達(dá)，對(duì)基因簇在肢體發(fā)育中時(shí)空線性表達(dá)的精細(xì)調(diào)控具有重要意義，為深入研究基因簇復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了參考。

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Serial deletions of tandem reverse CTCF sites reveal balancedregulatory landscape of enhancers

Ling Wang, Jinhuan Li, Haiyan Huang, Qiang Wu

The genome architectural protein CTCF (CCCTC-binding factor) not only mediates long-distance chromatin interactions between distal enhancers and target promoters, but also functions as an important insulator-binding factor to block improper enhancer activation of non-target promoters, and is thus of great significance to transcriptional regulation of developmental genes.The(Homeobox) gene family plays an important role in the development of the brain, bones, and limbs. The spatiotemporal colinear expression of thecluster along the proximal-distal axis of limbs is regulated by two clusters of enhancers known as super-enhancers located in the flanking regulatory regions. We focused on thecluster to explore the architectural role of CTCF in transcriptional regulation of developmental genes. Thecluster contains 9 paralogous genes intermixed with a series of CBS (CTCF-binding site) elements. Using the CRISPR DNA-fragment editing system, we generated a series of single-cell HEK293T clones with deletion of increasing numbers of reverse CBS elements. RNA-seq experiments revealed decreased levels ofgene expression. In addition, chromosome conformation capture experiments revealed increased long-distance chromatin interactions betweenand the upstream enhancer cluster and corresponding decreased interactions betweenand the downstream enhancer cluster. Thus, tandem reverse CTCF sites function as insulators to maintainregulatory balance between the upstream and downstream enhancer clusters. This study has interesting implications on the precise gene expression control of thefamily during animal development.

gene cluster; CTCF site; balanced regulatory mechanism; enhancer; insulator

2021-04-11;

2021-05-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31800636，31630039，91940303)和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(編號(hào)：19JC1412500)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31800636, 31630039, 91940303), and Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 19JC1412500)]

王玲，碩士研究生，專業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: wanglingmail0613@163.com

黃海燕，博士，副研究員，研究方向：藥物分子遺傳學(xué)。E-mail: hy_huang@sjtu.edu.cn

吳強(qiáng)，博士，教授，研究方向：基因表達(dá)調(diào)控及神經(jīng)發(fā)育。E-mail: qwu123@gmail.com

10.16288/j.yczz.21-132

2021/6/30 14:14:38

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210630.1109.002.html

(責(zé)任編委: 李大力)