崔大鵬 張迎春 宋文麗 張鵬娟 張星月 劉振顯 連晶晶 劉博

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1肝膽外科，2普通外科，3護(hù)理部，4檢驗(yàn)科，5病理科（河北張家口075000）

膽囊癌發(fā)病率居消化系統(tǒng)腫瘤的第6 位，占膽道腫瘤的80%～95%，多數(shù)患者起病隱匿，早期多缺乏典型表現(xiàn)，使得早期診斷較難，確診時(shí)已進(jìn)入晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［1］。目前膽囊癌疾病生物學(xué)機(jī)制研究尚不充分，缺少特異性預(yù)后標(biāo)志物［2-3］。癌胚抗原等消化道腫瘤常用腫瘤標(biāo)記物的特異性較低，對(duì)病情和預(yù)后的評(píng)估價(jià)值有限［4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1（astrocyte elevated gene?1，AEG?1）是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)［5-6］，但有關(guān)其與膽囊癌患者臨床病理及預(yù)后關(guān)系的研究仍較為缺乏。本研究以128 例膽囊癌患者為例，探討膽囊癌組織AEG?1 表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，以期填補(bǔ)研究空白，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2018年6月本院收治的128例膽囊癌患者，其中男49例、女79例；年齡31～82 歲，平均（53.61 ± 7.11）歲；臨床癥狀：右季肋區(qū)疼痛77 例、納差45 例、腹脹16 例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）采取手術(shù)治療，經(jīng)術(shù)后病理確診為膽囊癌；（2）術(shù)前無(wú)相關(guān)治療史；（3）簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有癌癥家族史者；（2）伴其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；（3）非原發(fā)性膽囊癌患者；（4）隨訪資料不完善或失訪者。

1.2 方法

1.2.1 癌組織AEG?1表達(dá)的檢測(cè) 128例患者均根據(jù)TNM分期接受相應(yīng)治療，其中42例采取根治術(shù)，包括單純膽囊切除術(shù)、根治性切除等；45 例接受姑息性手術(shù)，包括單純膽囊切除或胃腸吻合；41 例患者接受剖腹活檢術(shù)。術(shù)中均保留癌組織標(biāo)本進(jìn)行癌組織AEG?1 檢測(cè)：組織石蠟包埋、切片及脫蠟，修復(fù)抗原后牛血清白蛋白封閉。37 ℃下溫育一抗90 min（兔抗人AEG?1，北京中杉金橋），磷酸緩沖鹽溶液沖洗。二抗孵育20 min，使用二氨基聯(lián)苯胺試劑盒顯色。AEG?1 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色或棕色，顯微鏡下取不同視野確定AEG?1 陽(yáng)性染色細(xì)胞占比和染色程度。（1）AEG?1陽(yáng)性染色比例：陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜5%，0 分；5%～20%，1分；26%～50%，2分；＞50%，3分。（2）AEG?1陽(yáng)性染色強(qiáng)度：無(wú)染色，0 分；淡黃色，1 分；棕黃色，2 分；棕黃色，3 分。AEG?1 染色評(píng)分=染色比例評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，≤1 分，陰性；1～3 分，弱陽(yáng)性；＞3 分，陽(yáng)性。根據(jù)癌組織AEG?1 表達(dá)分為AEG?1 陽(yáng)性（92 例）和AEG?1 陰性（36 例）。

1.2.2 隨訪結(jié)果 術(shù)后隨訪2年，記錄生存時(shí)間。隨訪結(jié)束時(shí)存活患者生存時(shí)間為隨訪時(shí)間，死亡患者生存時(shí)間為隨訪開(kāi)始至死亡的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，比較采取χ2檢驗(yàn)，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多因素COX回歸分析確定膽囊癌患者生存影響因素，繪制Kaplan?Meier 生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌組織AEG?1 表達(dá)情況及組織病理學(xué)切片觀察 128 例膽囊癌患者中，癌組織AEG?1 陽(yáng)性表達(dá)率71.87%（92/128）。AEG?1 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕色。AEG?1 在組織中典型陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)圖1A），典型陰性表達(dá)見(jiàn)圖1B。

圖1 AEG?1膽囊癌組織中陽(yáng)性表達(dá)（A）和陰性表達(dá)（B）Fig.1 Positive expression（A）and negative expression（B）of AEG?1 in gallbladder carcinoma tissue

2.2 膽囊癌組織AEG?1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系不同腫瘤最大徑、病理分型、分化程度、TNM 分期、膽總管浸潤(rùn)、肝臟侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的AEG?1 陽(yáng)性例數(shù)的占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征的膽囊癌患者的AEG?1 表達(dá)比較Tab.1 Comparison of AEG?1 expression in gallbladder cancer patients with different clinicopathological characteristics例

2.3 膽囊癌的生存影響因素 以患者隨訪2年的生存情況（存活=1、死亡=0）為因變量進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示手術(shù)方式、腫瘤最大徑、分化程度、TNM 分期、膽總管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AEG?1表達(dá)是膽囊癌患者生存的影響因素（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 膽囊癌患者生存的多因素Cox 回歸分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of the survival of patients with gallbladder cancer

2.4 不同AEG?1 表達(dá)患者的生存分析 AEG?1 陽(yáng)性患者的生存率3.26%（3/92），陰性患者36.11%（13/36），Kaplan?Meier 生存曲線經(jīng)Log?rank 檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。見(jiàn)圖2。

圖2 AEG?1 陽(yáng)性和AEG?1 陰性患者的Kaplan?Meier 生存曲線Fig.2 Kaplan?Meier survival curve of AEG?1 positive and AEG?1 negative patients

3 討論

3.1 膽囊癌患者AEG?1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 既往實(shí)體瘤研究中發(fā)現(xiàn)AEG?1 在非小細(xì)胞肺癌患者中異常高表達(dá)，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系［7］。同時(shí)體外研究顯示子宮頸癌患者AEG?1 過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，128 例膽囊癌患者中AEG?1 陽(yáng)性率高達(dá)71.87%，高于楊安等［9］報(bào)道的胃癌患者中AEG?1 陽(yáng)性率50.65%和毛英等［10］報(bào)道的葡萄膜黑色素瘤患者中AEG?1 陽(yáng)性率的58%。國(guó)外研究認(rèn)為［11］，腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展均離不開(kāi)腫瘤血管生成，而AEG?1 高表達(dá)可增加微血管密度，促進(jìn)血管生成，增加腫瘤體積。膽囊癌的病理分型以腺癌為主，腺鱗癌、鱗癌較少見(jiàn)，通常只占10%～20%。有研究發(fā)現(xiàn)［12］，腺鱗癌、鱗癌常表現(xiàn)為腫瘤體積相對(duì)較大、腫瘤分期晚，預(yù)后相對(duì)較差，而AEG?1 陽(yáng)性會(huì)強(qiáng)化腫瘤的增殖和侵襲能力，這是造成本研究中鱗癌和腺鱗癌患者的AEG?1 陽(yáng)性率相對(duì)腺癌患者更高（87.50%vs.66.67%）的主要原因。常亮研究表明［13］，下調(diào)乳腺癌細(xì)胞AEG?1 表達(dá)后腫瘤細(xì)胞凋亡加快，提示AEG?1 可影響細(xì)胞周期阻滯，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡對(duì)患者臨床分期產(chǎn)生影響。AEG?1 陽(yáng)性可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化。因此AEG?1 陽(yáng)性的低分化占比更高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［14］，AEG?1 可通過(guò)增加低氧誘導(dǎo)因子?1α 表達(dá)的途徑間接提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，增加TNM 分期。此外，AEG?1 過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使腫瘤的侵襲能力加強(qiáng)，因此更易發(fā)生膽總管浸潤(rùn)、肝臟侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［15］。

3.2 AEG?1與膽囊癌患者預(yù)后 國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)［16］，AEG?1 是核轉(zhuǎn)錄因子κB 的正調(diào)控蛋白，可增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子κB 啟動(dòng)子活性，促使其與DNA 的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及血管新生。AEG?1 可激活磷酯酰肌醇?3 激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路及其下游基因，強(qiáng)化腫瘤的抗凋亡能力和侵襲能力［17］。本研究結(jié)果證實(shí)AEG?1 高表達(dá)參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、強(qiáng)化腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等多種途徑影響生存情況［18］。研究發(fā)現(xiàn)［19］，AEG?1 高表達(dá)會(huì)上調(diào)雙氫嘧啶脫氫酶等耐藥基因，影響腫瘤耐藥。國(guó)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［20］，小干擾RNA 沉默AEG?1 后，肝癌細(xì)胞對(duì)5?FU 敏感性提高。也有研究表明［21］，AEG?1 可通過(guò)對(duì)多藥耐藥基因表達(dá)的調(diào)控介導(dǎo)對(duì)阿霉素的耐藥。本研究COX 多因素回歸結(jié)果顯示，在校正混雜因素后，AEG?1 陽(yáng)性表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，提示靶向干預(yù)AEG?1 蛋白或其相關(guān)信號(hào)通路，有可能改善膽囊癌患者的預(yù)后，AEG?1 也可作為膽囊癌的治療潛在靶點(diǎn)。最近在消化道腫瘤體外研究中發(fā)現(xiàn)，AEG?1 與腫瘤增生和轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系。在胰腺細(xì)胞系中采用RNA 干擾AEG?1 基因表達(dá)后，可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［22］。而在胃癌組織中，AEG?1 可以通過(guò)eIF4E/cyclin D1 信號(hào)通路促使胃癌細(xì)胞增殖［23］。上述體外研究初步指明AEG?1 在消化道腫瘤中的潛在價(jià)值，而本文數(shù)據(jù)顯示膽囊癌患者中，AEG?1 陽(yáng)性表達(dá)是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。本研究隨訪時(shí)間較短，僅觀察了患者隨訪2年的生存情況，未能統(tǒng)計(jì)患者的遠(yuǎn)期生存，為研究不足之處，有待后續(xù)補(bǔ)充。

綜上所述，膽囊癌組織AEG?1 表達(dá)與患者腫瘤最大徑、病理分型、分化程度、TNM 分期、周?chē)M織侵犯等臨床病理特征有較大關(guān)聯(lián)，且AEG?1 陽(yáng)性是預(yù)后影響因素。