李媛 龍富立 張衎 官志杰 姚凡 彭云鶴 舒發(fā)明 唐春回 毛德文 黃古葉

1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病科（南寧530023）；2廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室培育基地（南寧530023）；3廣西巴馬瑤族自治縣民族醫(yī)院（廣西河池547500）

乙肝肝硬化（hepatitis B cirrhosis，HBC）是一種由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染所引起的慢性、彌漫性肝損傷疾病［1］。近年來，中藥已成為治療HBC 的首選藥物之一［2］。健肝顆粒是依據(jù)臨床經驗研制的經驗方，具有良好的抗肝纖維化、抗脂質過氧化物形成等效果，可顯著改善乙肝患者肝功能［3］，應用前景良好。CD4+T 細胞的凋亡壞死是HBV 感染后導致機體細胞免疫功能障礙的重要原因之一［4］。最新研究表明，線粒體自噬在肝臟免疫反應調節(jié)中具有重要作用［5］，PINK1/Parkin/ROS 介導的線粒體自噬可提高細胞活性，抑制細胞凋亡［6］，這有利于CD4+T 細胞的存活及免疫功能的發(fā)揮。故本研究擬通過采集臨床HBC 代償期患者經常規(guī)抗病毒治療及聯(lián)合健肝顆粒治療后外周血，基于線粒體自噬PINK1/Parkin/ROS 信號通路，探究健肝顆粒對磁珠分選CD4+T細胞氧化應激及凋亡的作用機制，旨在為健肝顆粒的開發(fā)及應用提供更多科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 健肝顆粒組方（田七10 g，地龍10 g，半夏10 g，川芎10 g，白芍10 g）由我院藥劑科提供。

1.2 患者一般資料 隨機選取2018年7月至2019年12月在我院就診的HBC 代償期患者100 例，隨機分為對照組和觀察組，每組各50 例；其中，對照組男27 例，女23 例，年齡（40.2±9.5）歲；觀察組男25 例，女25 例，年齡（40.9 ± 10.6）歲；另外，隨機選取同期至我院的健康體檢者共50 例為正常組，男28 例，女22 例，年齡（41.2 ± 12.8）歲。各組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。患者納入標準：患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年）》HBC 診斷標準［7］，知情并同意參與本研究（倫審2019?011?01）?；颊吲懦龢藴剩汉喜⑵渌《靖腥荆纾杭?丙/丁/戊型肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等，合并酒精性肝病及自身免疫性疾病，接受手術、放化療及免疫治療的肝癌患者等。

1.3 試劑 CD4+T 細胞陽選試劑盒（Miltenyi 130?090?860）；ROS 試劑盒（mlbio，ml009876?1）；MDA試劑盒（Elabscienc，E?EL?0060c）；SOD 試劑盒（Elabscience E?BC?K019?S）；Annexin V FITC/PI 試劑盒（Solarbio CA1020?50T）；JC?1 熒光探針試劑盒（碧云天C2006）；Anti?PINK1 antibody（abcam，ab216144）；Anti?Parkin antibody（abcam，ab77924）；Anti?LC3?Ⅱantibody（abcam，ab48394）；Anti?Bax antibody（abcam，ab32503）；Anti?Bcl?2 antibody（ab?cam，ab59348）；Anti? β ?actin antibody（abcam，ab8227）；山羊抗鼠二抗（Sigma A9309）；山羊抗兔二抗（Sigma A9169）。

1.4 儀器 細胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO，CLM?170B?8?NF）、流式細胞儀（BD FACSMelody）、多功能酶標儀（美國MD FilterMax F3）、電泳儀（Bio?Rad Power?Pac Basic）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能Tanon 5200）。

1.5 方法

1.5.1 治療方法及樣品處理 對照組采用恩替卡韋（博路定，國藥準字H20052237，0.5 mg*7 片）治療，0.5 mg/次，1 次/d。觀察組采用健肝顆粒聯(lián)合恩替卡韋治療，恩替卡韋0.5 mg/次，1 次/d，健肝顆粒1 包/次，2 次/d，兩組均治療3 個月。分別采集對照組和觀察組患者治療前、后及正常組的外周靜脈血各5 mL，進行后續(xù)實驗。正常組靜脈血經磁珠分選得到CD4+T 細胞后，分為Control 組、H2O2組和H2O2+CCCP（線粒體自噬激活劑）組，并進行以下處理［8］：H2O2組使用100 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，H2O2+CCCP 組使用100 μmol/L H2O2和5 μmol/L CCCP 共培養(yǎng)24 h。

1.5.2 免疫磁珠分選CD4+T 細胞 使用10 mL PBS 稀釋血液樣本后，加入10 mL 淋巴細胞分離液，采用密度梯度離心法分離外周靜脈血中單核細胞，使用含10%血清RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細胞，為單核細胞懸液。計數(shù)后按照1 × 107個細胞加入含10%磁珠的磁珠分選緩沖液100 μL，充分混勻后于4 ℃冰箱中避光孵育15 min。根據(jù)CD4+T 細胞陽選試劑盒進說明書行操作，經過柱、洗脫、洗滌及離心等步驟得到CD4+T 細胞團，使用RPMI1640 培養(yǎng)液洗滌重懸，按每孔2×106/2 mL 密度接種于6 孔板中培養(yǎng)。

1.5.3 Western blot 法檢測PINK1/Parkin 通路關鍵蛋白的表達 各組樣品使用RIPA 消化，收集細胞裂解液。BCA 法進行蛋白濃度測定，5 × Load?ing buffer 混勻，沸水浴5 min；每泳道上樣20 μg 蛋白，SDS?PAGE 電泳，切膠，轉膜，5%脫脂奶粉浸泡，室溫封閉約1 h。將膜與一抗于4 ℃過夜孵育，1 × TBST 清洗；二抗37 ℃孵育1 h，1 × TBST 清洗；顯色曝光后行底片掃描，統(tǒng)計蛋白灰度值。

1.5.4 Annexin V FITC/PI 檢測細胞凋亡 使用4 ℃PBS 洗滌待檢測細胞，離心后使用1 mL Bind?ing Buffer 重懸細胞，取出100 μL 細胞，加入5 μL Annexin V?FITC，室溫避光孵育10 min，后加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min，隨后加入400 μL PBS，使用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.5.5 JC?1 熒光探針檢測線粒體膜電位 取各組細胞種于12 孔板中，待細胞融合至80%棄去培養(yǎng)基，加入終濃度為1 μg/mL 的JC?1 熒光探針染料，培養(yǎng)箱中孵育20 min，JC?1 染色緩沖液清洗后，加入1 mL 培養(yǎng)基，使用流式細胞儀檢測紅色熒光強度，紅色熒光越強，線粒體膜電位越高。

1.5.6 ELISA法檢測ROS、MDA、SOD的含量 根據(jù)ROS、MDA、SOD ELISA 試劑盒使用說明進行操作，于酶標儀檢測各孔光密度值（OD），根據(jù)標準品結果描繪標準曲線，計算血清ROS、MDA、SOD含量及CD4+T 細胞ROS 含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料結果以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健肝顆粒對HBC 代償期患者氧化應激水平的影響 ELISA 檢測結果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的ROS 和MDA 含量升高，SOD 含量降低（P< 0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的ROS 和MDA 含量降低，SOD 含量升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1?3。

圖1 各組血清中ROS 含量的比較Fig.1 Comparison of the content of ROS in serum of each group

圖2 各組血清中MDA 含量的比較Fig.2 Comparison of the content of MDA in serum of each group

圖3 各組血清中SOD 含量的比較Fig.3 Comparison of the content of SOD in serum of each group

2.2 健肝顆粒對HBC 代償期患者CD4+T 細胞凋亡的影響 Western blot 和流式細胞術檢測結果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的Bax表達和細胞凋亡率均升高，Bcl?2 的表達降低（P<0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的Bax 表達和細胞凋亡率均降低，Bcl?2 的表達升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見圖4、5。

圖4 各組細胞中Bax 和Bcl?2 蛋白表達水平比較Fig.4 Comparison of protein expression levels of Bax and Bcl?2 in cells of each group

圖5 各組細胞凋亡率的比較Fig.5 Comparison of apoptosis rate in cells of each group

2.3 線粒體自噬對體外誘導的CD4+T 細胞氧化應激模型的影響 通過H2O2誘導建立CD4+T 細胞氧化應激模型，并使用線粒體自噬誘導劑CCCP 上調線粒體自噬水平，結果顯示，相較于Control 組，H2O2組的ROS 含量和細胞凋亡率升高，LC3?Ⅱ的表達降低（P<0.05）；而相較于H2O2組，H2O2+CCCP組的ROS 含量和細胞凋亡率降低，LC3?Ⅱ的表達升高（P<0.05）。見圖6?8。

圖6 各組細胞中ROS 含量Fig.6 Comparison of ROS content in cells of each group

圖7 各組細胞中LC3?Ⅱ蛋白表達水平的比較Fig.7 Comparison of protein expression levels of LC3?Ⅱin cells of each group

圖8 各組細胞凋亡率的比較Fig.8 Comparison of apoptosis rate in cells of each group

2.4 健肝顆粒對患者CD4+T 細胞線粒體自噬的影響 Western blot 和流式細胞術檢測結果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達水平以及線粒體膜電位水平均降低（P< 0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達水平以及線粒體膜電位水平均升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖9、10。

圖9 各組細胞中PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達水平比較Fig.9 Comparison of expression levels of PINK1，Parkin and LC3?Ⅱin cells of each group

圖10 各組細胞中線粒體膜電位水平比較Fig.10 Comparison of mitochondrial membrane potential levels in cells of each group

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經過程，代償期是疾病進展的早期階段，可有效逆轉［9］。肝損傷和肝纖維化的初期，持續(xù)的、不可逆的氧化應激可導致肝細胞膜脂質過氧化、細胞功能異常，最終誘導細胞凋亡［10］。研究表明，ROS 的過量蓄積可促進肝纖維化的形成［11］。MDA 是細胞膜脂質過氧化反應鏈的終產物，SOD 是機體抗氧化體系的主要酶類。本研究發(fā)現(xiàn)，HBC 代償期患者血清ROS 和MDA 含量升高，SOD 含量降低，與既往研究結果一致［12-13］，表明HBC 代償期患者機體呈現(xiàn)高氧化應激狀態(tài)，提示抗氧化治療是促進疾病轉歸的重要手段。

祖國醫(yī)藥認為，肝硬化屬“黃疸”、“脅痛”、“瘀血”、“積聚”的范疇，其病機主要為濕熱所致毒損肝絡，氣滯血瘀，濕濁積聚，而致毒、痰、瘀互結［14］。健肝顆粒組方，具有活血益氣、去瘀生新、清肺化痰、柔肝止痛、疏肝開郁等功效。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用健肝顆粒治療HBC 代償期患者，可有效降低ROS 和MDA 含量，增加SOD 含量，降低機體氧化應激水平，且效果優(yōu)于單用恩替卡韋，表明健肝顆?？梢种艸BC 代償期患者的氧化應激水平，抗氧化效應顯著。

臨床研究表明，慢性HBV 持續(xù)感染會致先天性和適應性免疫反應功能障礙，涉及單核細胞/巨噬細胞、NK 細胞、T 細胞［15］。其中，特異性CD4+T細胞通過識別肝細胞表面的HBV 產生特異性細胞因子，從而參與肝臟的免疫應答，對HBV 的殺滅、清除具有關鍵作用。研究表明，由CD4+T 細胞介導的細胞免疫在肝硬化患者中免疫應答微弱，且CD4+T 細胞凋亡與肝硬化進程及歸轉有關［16-17］。在細胞凋亡機制中，促凋亡因子Bax 和抑凋亡因子Bcl?2 的異常表達可促進肝臟疾病進展［18?19］。既往研究已表明，健肝顆粒治療乙型肝炎患者可提高外周血CD4+T 細胞計數(shù)及患者細胞免疫功能，且療效優(yōu)于單用恩替卡韋［20］，提示健肝顆粒對HBC 的作用機制與CD4+T 細胞有關。本研究發(fā)現(xiàn)，健肝顆粒聯(lián)合恩替卡韋可顯著降低CD4+T 細胞凋亡率，抑制Bax，上調Bcl?2，效果優(yōu)于單用恩替卡韋，表明健肝顆?？赡芡ㄟ^抑制CD4+T 細胞凋亡，進而調節(jié)HBC 患者細胞免疫功能。

機體氧化與抗氧化失衡時，可致ROS 過量生成，誘導細胞凋亡。線粒體是ROS 生成的“能量工廠”，其功能障礙可增加ROS 水平，引發(fā)機體氧化應激損傷［21］，促進肝纖維化。在正常情況下，線粒體可啟動線粒體自噬機制，通過選擇性自噬清除受損線粒體，維持線粒體膜電位以及限制ROS 過量累積，從而維持氧化/抗氧化平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可提高CD4+T 細胞ROS 含量和細胞凋亡率，與HBC 患者機體高氧化應激狀態(tài)以及細胞免疫功能障礙機制一致，而CCCP 誘導線粒體自噬發(fā)生可降低ROS 含量，減少CD4+T 細胞凋亡，表明激活線粒體自噬有利于抑制CD4+T 細胞的氧化應激和細胞凋亡，促進氧化/抗氧化平衡。

PINK1/Parkin 通路是介導線粒體自噬的重要途徑。研究表明，線粒體功能障礙可加速肝纖維化進程，而上調PINK1 蛋白水平可發(fā)揮抗肝纖維化作用［22］，表明PINK1/Parkin 通路與肝纖維化進程有著密切的聯(lián)系。自噬標記物LC3?Ⅱ定位于自噬小體，是檢測自噬水平的金標準。本研究發(fā)現(xiàn)，HBC 代償期患者CD4+T 細胞中PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達以及線粒體膜電位水平均顯著低于正常者，表明患者CD4+T 細胞的線粒體自噬水平被抑制，這可能是加重HBC 患者機體高氧化應激狀態(tài)以及細胞免疫功能障礙的重要機制。此外，相較于單用恩替卡韋，聯(lián)合健肝顆粒治療可上調患者CD4+T 細胞中PINK1、Parkin、LC3?Ⅱ的表達，升高線粒體膜電位，表明健肝顆?？赡芡ㄟ^激活PINK1/Parkin 通路進而抑制HBC 進展。由此可推測，在HBC 患者外周血CD4+T 細胞中，PINK1/Parkin 通路介導的線粒體自噬被抑制或功能無法正常發(fā)揮，使受損線粒體無法及時清除，導致ROS過量蓄積，細胞氧化與抗氧化機制失衡，出現(xiàn)高氧化應激狀態(tài)，促進細胞凋亡，致使細胞免疫障礙，加速了肝硬化進程。而健肝顆?？赏ㄟ^上調粒體自噬水平，發(fā)揮抗氧化效應，抑制CD4+T 細胞凋亡，進而治療HBC。

綜上所述，氧化應激導致的CD4+T 細胞凋亡是促進HBV 感染，進而導致肝纖維化發(fā)展至HBC的重要因素之一。在HBC 代償期患者中，健肝顆?？赏ㄟ^PINK1/Parkin/ROS 通路誘導線粒體自噬抑制HBC 患者CD4+T 細胞凋亡，阻斷肝硬化進程，極具臨床應用價值，值得進一步推廣。