王 悅 孟湃喆 于艷紅▲

1.沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110044；2.沈陽(yáng)市醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)，遼寧沈陽(yáng) 110034

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）位居全球單一致死性傳染病的首位，每年約有50 萬(wàn)利福平耐藥病例，其中78%為耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）[1]。我國(guó)是全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最大的三個(gè)國(guó)家之一[2-3]。由于傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣，無(wú)法滿足快速臨床診斷的要求[4-5]，許多快捷高效的分子技術(shù)已更多應(yīng)用于TB 檢測(cè)，包括熒光PCR熔解曲線法、線性探針耐藥檢測(cè)法或DNA 微陣列等。熒光PCR熔解曲線技術(shù)特點(diǎn)是在擴(kuò)增完成后增加了熔解曲線的分析過(guò)程，比較樣本與陽(yáng)性對(duì)照間熔點(diǎn)差異（△Tm值）。該技術(shù)對(duì)rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)81bp 進(jìn)行突變檢測(cè)；對(duì)與異煙肼耐藥相關(guān)的ahpC啟動(dòng)子、inhA94 密碼子、inhA啟動(dòng)子以及katG315 密碼子的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行特異檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2019年7月—2020年7月沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院收取的254 例痰樣本檢驗(yàn)結(jié)果，三項(xiàng)檢測(cè)為同一患者的同一樣本，排除標(biāo)準(zhǔn)為治療超過(guò)2 周的患者。以MGIT 960 藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，探討熔解曲線技術(shù)在結(jié)核病耐藥診斷中的應(yīng)用價(jià)值，并采用線性探針耐藥檢測(cè)技術(shù)對(duì)不一致結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢。本研究經(jīng)過(guò)沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 主要儀器及試劑 Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad Laboratories）；Lab-Aid 824 核酸提取儀、結(jié)核分枝桿菌利福平/異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）；MGIT 960 全自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法儀及配套試劑（Becton，Dickinson and Company）；全自動(dòng)核酸印記微生物檢測(cè)系統(tǒng)（GTGBlot 48）及配套試劑（法國(guó)生物梅里埃股份有限公司）。

1.2 方法

收集254 例痰樣本檢驗(yàn)結(jié)果，熔解曲線法與MGIT 960 藥敏試驗(yàn)不一致的結(jié)果應(yīng)用世衛(wèi)組織推薦的線性探針耐藥檢測(cè)法進(jìn)行復(fù)檢，三種方法如下。

MGIT960 藥敏試驗(yàn)：痰標(biāo)本前處理按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]規(guī)定進(jìn)行，完成接種后，進(jìn)行培養(yǎng)，儀器報(bào)陽(yáng)后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行抗酸染色鏡檢確認(rèn)，陽(yáng)性者進(jìn)入藥敏試驗(yàn)。

熔解曲線法前處理：取培養(yǎng)法前處理液化完成的痰液1.5 mL，高速離心后棄上清并加入TB DNA 提取液重懸沉淀，滅活后進(jìn)行核酸提取、配液、擴(kuò)增等工作流程。檢驗(yàn)結(jié)果是通過(guò)四個(gè)通道的樣品與陽(yáng)性對(duì)照之間熔解曲線熔點(diǎn)（Tm）的差異判斷樣品是否發(fā)生突變，熔點(diǎn)均一致（誤差不超過(guò)1℃）時(shí)判定為野生型（敏感）；四個(gè)通道中任意通道中樣品的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2℃判定為突變型（耐藥）。

線性探針耐藥檢測(cè)法：標(biāo)本處理按照法國(guó)生物梅里埃的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，包括DNA 提取、擴(kuò)增、雜交、制備流程。判讀標(biāo)準(zhǔn)為野生條帶均顯色且突變條帶無(wú)顯色時(shí)為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有檢測(cè)結(jié)果、患者基本信息采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以MGIT 960 藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熔解曲線法檢測(cè)的敏感性、特異性、一致性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predictive value，PPV）、陰性預(yù)測(cè)值（negative predictive value，NPV）和Kappa值以及對(duì)MDR-TB 結(jié)果的判定能力。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%；PPV=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%；NPV=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性）例數(shù)×100%；一致性=（真陽(yáng)性+真陰性）/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性+真陰性+假陰性）例數(shù)×100%；Kappa值≥0.75 表示兩者一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75 表示兩者一致性一般；Kappa＜0.4 表示兩者一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

收集的254 例患者信息顯示，初治患者166 人（65.4%）；年齡18～88 歲，平均（52±14.6）歲；41～60年齡段人數(shù)為123 人（48.4%），男性199 人（78.3%）。

2.2 藥敏結(jié)果

在利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果中，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為89.6%、95.6%，Kappa值≥0.75，與參考標(biāo)準(zhǔn)一致性較好；兩種檢測(cè)技術(shù)共有14 例不一致。在異煙肼藥敏試驗(yàn)結(jié)果中，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為81.5%、98.9%，Kappa值≥0.75，與參考標(biāo)準(zhǔn)一致性較好；兩種檢測(cè)技術(shù)共有14 例不一致（表1）。

表1 熔解曲線法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥與MGIT 960 藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較（例數(shù)）

2.3 應(yīng)用線性探針耐藥檢測(cè)技術(shù)對(duì)不一致結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢

254 例藥敏結(jié)果中，熔解曲線共有28 例結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)不同。其中有17 例是熔解曲線法顯示敏感，而MGIT 960 藥敏試驗(yàn)為耐藥，線性探針耐藥檢測(cè)復(fù)檢為12 例耐藥，5 例敏感；有11 例是熔解曲線法顯示耐藥，而MGIT 960 藥敏試驗(yàn)為敏感，線性探針耐藥檢測(cè)復(fù)檢為3 例敏感，8 例耐藥。

2.4 熔解曲線法檢測(cè)MDR-TB 的效能

檢測(cè)所有病例MDR-TB 的能力與參考標(biāo)準(zhǔn)比較，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為80.5%、95.8%，Kappa值為0.76，二者一致性較好。初治患者的敏感性和特異性均高于復(fù)治患者，其Kappa值為0.93，優(yōu)于復(fù)治患者的0.60（表2）。

表2 熔解曲線法對(duì)不同治療史樣本患者M(jìn)DR-TB 結(jié)果的判定（例數(shù)）

3 討論

與MGIT960 藥敏法比較，熒光PCR熔解曲線法對(duì)兩種藥物的耐藥檢測(cè)指標(biāo)較好，但是異煙肼耐藥檢測(cè)的敏感性略低于利福平，可能是由于利福平耐藥突變的檢測(cè)限略高的原因。關(guān)于不一致結(jié)果的產(chǎn)生原因較復(fù)雜，MGIT 960 藥敏法耐藥而熔解曲線法敏感的可能原因：①分子法是針對(duì)特定突變位點(diǎn)的密碼子的檢測(cè)，不能覆蓋所有的突變位點(diǎn)；②耐藥機(jī)制除了位點(diǎn)突變還存在外排泵[7-8]等；③可能存在異質(zhì)性耐藥[9]，一般分子法的檢測(cè)限在20%左右，而培養(yǎng)法的檢測(cè)限可達(dá)到1%[10]。MGIT 960 藥敏法敏感而熔解曲線法檢測(cè)耐藥的可能原因：①體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致耐藥菌亞群比例下降、低于培養(yǎng)法檢測(cè)靈敏度[11]；②異質(zhì)性耐藥或DNA 純度不夠，導(dǎo)致熔解曲線出現(xiàn)各種雜合峰或復(fù)雜曲線，受到儀器性能和人工判讀的影響較大[12]；③可能與MGIT 960 藥敏法的利福平終濃度設(shè)置過(guò)高有關(guān)（培養(yǎng)管中的藥物終濃度為利福平1.0 μg/mL，異煙肼0.1 μg/mL）；④分子藥敏檢測(cè)出rpoB基因511位點(diǎn)和inhA突變時(shí)，表型藥敏往往檢測(cè)結(jié)果為陰性[13]。參考《結(jié)核分枝桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)專家共識(shí)》[14]的建議，當(dāng)分子藥敏試驗(yàn)和表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致時(shí)，需參考對(duì)不同抗結(jié)核藥品分子藥敏試驗(yàn)檢測(cè)敏感度和特異度[15]。

應(yīng)用線性探針耐藥技術(shù)對(duì)不一致結(jié)果的復(fù)檢顯示，在利福平耐藥檢測(cè)方面，線性探針更傾向于與參考標(biāo)準(zhǔn)一致，由于是對(duì)不一致結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢，不能以與參考標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果符合度高更多而斷定線性探針?lè)椒▋?yōu)于熔解曲線法。我國(guó)對(duì)異煙肼耐藥的菌株中約有3%攜帶axyR-ahpC基因突變[16]，與線性探針比較，是熔解曲線法的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，所以復(fù)檢指標(biāo)中線性探針與參考指標(biāo)比較的符合度低于利福平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不一致結(jié)果中抗酸染色鏡檢3+以上即菌量較多標(biāo)本，兩種分子法一致且都與參考標(biāo)準(zhǔn)不同，這很可能與異質(zhì)性耐藥和檢測(cè)限有關(guān)。

對(duì)于MDR-TB 的判定，熔解曲線法更適用于初治人群，這可能是由于：①?gòu)?fù)治患者治療過(guò)程中藥物選擇作用下產(chǎn)生的突變并不引起氨基酸改變；②復(fù)治患者在治療中出現(xiàn)的耐藥突變更為復(fù)雜，超出了分子法檢測(cè)突變的范圍[17]。本實(shí)驗(yàn)的不足在于沒(méi)有對(duì)不一致結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，可以在未來(lái)的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法實(shí)現(xiàn)了模塊封閉性自動(dòng)化檢測(cè)，雖然無(wú)法取代表型藥敏技術(shù)，但是其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，仍適用于結(jié)核病耐藥初篩，MDR-TB 患者可以通過(guò)盡快原則適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行二線藥物快速治療，取得更好的療效。