尹寶英,張文娟,朱小甫,張 浩

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 咸陽市動物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000; 2.陜西正大有限公司，陜西 咸陽 712000)

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea, PED)是我國2010年以來阻礙養(yǎng)豬業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的主要疫病之一[1～2]。感染PED的豬只主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和脫水，PED病毒會引起初生哺乳仔豬脫水死亡，致死率可高達100%。另因腹瀉造成的母豬發(fā)情異常、流產(chǎn)、仔豬殘次率高等間接損失難以估算[3]。該病在全國各地呈暴發(fā)流行，近年發(fā)生的季節(jié)性越來越不明顯，部分豬場呈間歇性發(fā)病。2018年對陜西部分規(guī)?；i場送檢的162份腹瀉樣品檢測結(jié)果中PEDV的陽性檢出率分別為16.04%[4]，對陜西省養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PED目前的防控主要是通過給妊娠母豬接種疫苗，讓仔豬通過初乳以被動免疫的方式獲得抵抗力，但由于該病存在發(fā)病日齡早、混合感染、病毒的基因變異以及商品疫苗免疫效果不理想等諸多問題，市售商品苗并沒有起到理想的防護效果，PED復(fù)發(fā)始終存在[5]。國外豬場在發(fā)生 PED 時，通常采用返飼技術(shù)，使豬群在短期內(nèi)集中感染，刺激母豬產(chǎn)生抗PED病毒抗體[6～7]。本實驗采用返飼制備高免血清對陜西某頻發(fā)PED豬場進行防治的效果觀察，旨在探索和篩選在臨床上治療豬流行性腹瀉的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源和實驗動物 病料來自咸陽地區(qū)養(yǎng)豬場3～7日齡發(fā)生PED初期的仔豬腸道樣本。病豬表現(xiàn)精神不振，食欲差，嘔吐，頻頻拉白色、黃白色或黃綠色水樣稀糞，嚴重脫水；嘔吐、脫水和死亡。樣品在-80℃ 冰箱保存；昆白鼠20只；產(chǎn)前90 d妊娠母豬6頭。

1.1.2 材料 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa9766)、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa RR055B)、瓊脂糖(AOBOX)均購自寶生物工程(大連)有限公司；PDEV ELISA抗體檢測試劑盒(青島捷世康)、50×TAE( 北京博奧拓達)、0.9% 生理鹽水、雙抗、LB 培養(yǎng)基等均為國產(chǎn)化學(xué)試劑。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中公布的PEDV毒株全基因序列( 登錄號為 AF353511)，通過Premier 5.0軟件設(shè)計，5’-GAA GTA ACC ACG GTC GTG-3’，5’-GCT CTC GAA CAG CCC CAT TA-3’目的擴增基因片段長度為495 bp，與偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環(huán)病毒等病原引物合成由生工生物工程( 上海) 有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 返飼材料制備 返飼材料為3日齡內(nèi)發(fā)病，24 h內(nèi)確診PED的仔豬的整段腸道及內(nèi)容物，經(jīng)RT-PCR病原檢測，偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環(huán)病毒等病原檢測為陰性。稱重按每100 g加入100 mL含青鏈霉素各60萬單位的生理鹽水，用組織搗碎機勻漿，48 h內(nèi)冷藏使用。

1.2.2 血清制備 將上述制備好的抗原組織按每頭豬50 mL量返飼健康豬只，次日以超30%的豬只出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、厭食為標(biāo)準(zhǔn)，進行第二輪返飼，二次返飼后出現(xiàn)臨床癥狀豬只比例超過90%，證明返飼成功。二次返飼后每隔3 d清晨空腹經(jīng)前腔靜脈無菌采血，自然凝固分離血清，進行PEDV IgG抗體檢測大量采集達到峰值血清作為備用高免血清，56 ℃滅活1.5 h，自然冷卻后，加入青鏈雙抗，密封冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗血清檢驗 無菌檢查：將分離的血清分別接種于普通培養(yǎng)基與鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察是否有菌落生長。

安全性試驗：將培養(yǎng)無細菌生長的血清對體重18～22 g的健康小白鼠5只進行皮下注射，每只0.5 mL，觀察一周，每日量體溫，觀察是否發(fā)病。

特定病原檢測：對備用篩選血清、返飼供體豬只的糞便和肛門拭子進行特定病原檢測。

1.2.4 預(yù)防試驗 隨機選取發(fā)病豬場PED免疫母豬所產(chǎn)初生仔豬，試驗組22頭，對照組26頭。試驗組于仔豬出生后2 h內(nèi)每頭灌服高免血清5 mL，隔日再灌服1次。對照組不做處理。試驗日至斷奶日期間觀察豬只有無出現(xiàn)嘔吐，黃白色或黃綠色水樣稀糞等PED臨床癥狀，判斷保護率。

1.2.5 治療試驗 選用發(fā)病豬場自然發(fā)病初生仔豬，經(jīng)診斷為PED感染的4窩仔豬47頭，根據(jù)分娩先后，按自然窩，隨機分成2個組，即血清治療組與常規(guī)藥物治療對照組，血清治療組2窩23頭，視患豬的日齡，體重大小，每頭每次灌服自制血清3～4 mL。如24 h內(nèi)未痊愈的，可再注射同樣劑量1次。藥物治療組(黃芪多糖，楊樹花 )2窩24頭，按患病仔豬的體重大小，采取不同劑量分別口服黃芪多糖和楊樹花，每天2次，連續(xù)2 d。試驗期間密切觀察仔豬臨床變化，3 d內(nèi)精神恢復(fù)正常，腹瀉停止，精神、食欲、糞便狀態(tài)恢復(fù)正常，判斷為治愈。否則，判為無效。

2 結(jié)果

2.1 PEDV抗體檢測

用ELISA方法檢測返飼后血清中PEDV IgG抗體水平，計算平均值。如圖1所示，IgG抗體水平峰值出現(xiàn)在返飼后第19天，均值可達到1.836，高水平表達至第25天左右。

2.2 高免血清的無菌檢査、安全性試驗和PEDV檢測

將滅活測定高效價血清分別接種于普通培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng), 未發(fā)現(xiàn)任何細菌生長；皮下注射昆白鼠未發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)。流行性腹瀉、偽狂犬、豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和圓環(huán)病毒等病原檢測為陰性。

2.3 高免血清預(yù)防試驗

預(yù)防試驗仔豬在20日齡內(nèi)未出現(xiàn)大規(guī)模嘔吐，頻頻拉白色、黃白色或黃綠色水樣稀糞等癥狀。由表1數(shù)據(jù)可知，高免血清+疫苗組和疫苗組的發(fā)病率為9.09%和38.46%，截止斷奶期高免血清+疫苗組和疫苗組的淘汰率分別為13.64%和26.92%，差異顯著(P<0.05)。

表1 預(yù)防效果比較

2.4 高免血清治療試驗

由表2可知，治療，高免血清組和藥物對照組對PED的治愈率分別為82.6%和16.67%，未治愈死亡率分別為17.4%和83.3%。高免血清組與藥物對照組之間有極顯著差異 (P<0.01)。

表2 治療效果比較

3 小結(jié)與討論

豬流行性腹瀉是近年來困擾養(yǎng)豬業(yè)的一項重大腸道傳染病，但由于毒株差異以及疫苗實際應(yīng)用程序復(fù)雜而保護率差異很大。大多數(shù)情況下，PEDV的感染仍然是能引起仔豬大量死亡的棘手疾病。僅僅依靠商品疫苗免疫很難及時有效防控PED造成巨大損失。臨床上常常返飼妊娠母豬利用人工自然免疫使得妊娠母豬在短期內(nèi)集中感染，從而在分娩時獲得高效的母源抗體[6]，利用母源抗體保護后代仔豬度過危險期。國內(nèi)由于豬場病原比較復(fù)雜，因返飼后部分母豬持續(xù)排毒，反復(fù)爆發(fā)，導(dǎo)致返飼風(fēng)險措施的安全性和有效應(yīng)用不被認可[5～8]。筆者應(yīng)用場內(nèi)返飼方法制備高免血清，既能針對性的保證病原的較高抗原性又能保證的安全性。筆者研究通過給成年健康豬2只次大量的返飼后采取第19天IgG處于峰值期的高免血，清效價均值1.84，同時PED病原檢測為陰性。進行臨床預(yù)防治療試驗，結(jié)果顯示本研究制備的高免血清可以提供的93.2%的保護率和87.5%的治愈率，防治效果非常顯著，說明該方法自制高免血清能起到較好的預(yù)防與治療效果，具有很高的臨床價值，同時操作簡單、安全有效。

初生仔豬腹瀉原因復(fù)雜，因此血清治療必須配合科學(xué)分析進行防治，并要根據(jù)實際情況加強母豬、仔豬飼養(yǎng)管理，做好保溫、衛(wèi)生等環(huán)境工作；合理防疫，及時讓初生仔豬吃足初乳，增強仔豬抵抗力；必要時采用結(jié)合抗生素治療，才能更好地發(fā)揮防治作用。