閆學(xué)莉，高明偉，王志強(qiáng)，李建偉，李星星，李超

（1.山西省呂梁市中心血站，山西 呂梁 033000；2.山西省呂梁市人民醫(yī)院，山西 呂梁 033000；3.山西省醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030000）

0 引言

人類血小板特異性抗原（Human Platelet Alloantigens,HPA）是表達(dá)在血小板膜糖蛋白（GP）上的抗原表位[1]，是血小板本身固有的抗原，主要分布 在GP Ⅱb，GP Ⅲa，GPIa，GPIbCD109 上[2]，此抗原是由遺傳決定的[3]，為常染色體雙等位基因共顯性遺傳[4]。其基因頻率在不同種族、不同地域分布各不相同。近年來(lái)，隨著成分輸血的開展，血小板輸注多用于防止和治療血小板減少癥或血小板功能缺損病人的輸血，輸注過(guò)程中可能會(huì)因?yàn)镠PA 不相容會(huì)引起血小板同種免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生血小板同種抗體[5]，引起胎兒或新生兒出現(xiàn)一系列輸血不良反應(yīng)。對(duì)山西省呂梁市血小板特異性抗原基因多態(tài)性研究，為其提供有效指導(dǎo)，減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究評(píng)估了山西呂梁地區(qū)400 名漢族人HPA 基因多態(tài)性分布，彌補(bǔ)了該地區(qū)此項(xiàng)研究的空白，探討了血小板同型輸注的可能性，以期對(duì)該地區(qū)血小板采集和治療提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

山西省呂梁市本地漢族人群，樣本為呂梁市中心血站隨機(jī)血液標(biāo)本400份，樣本儲(chǔ)存于EDTA抗凝管中，所有研究對(duì)象均無(wú)血緣關(guān)系和血液制品輸注史。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Applied Biosystems 公司PCR 儀、北京六一生物科技有限公司DYY-6D 電泳儀，美國(guó)Syngene 核酸凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 試劑

試劑盒選擇由北京solarbio 提供的全血基因組DNA、Taq 酶等。

1.3 全血基因組提取

使用紅細(xì)胞裂解液對(duì)樣本進(jìn)行處理，處理后的樣本利用柱膜法提取基因組DNA，并對(duì)提取的DNA 進(jìn)行質(zhì)控，DNA 濃度OD260/OD280 在1.8～2.0 時(shí)為合格。

1.4 DNA 擴(kuò)增

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)樣本DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL：Buffer 2μL，dNTPs 1.5μL（2.5μM），正反向擴(kuò)增引物各1μL，Taq DNA 聚合酶0.1μL（5U/μL），ddH2O 13.5μL，DNA 1μL。引物以相關(guān)文獻(xiàn)為參考，由上海生工生物有限公司合成。HPA 1、2、3、4、5、6、15 擴(kuò)增條件：①95℃預(yù)變性5min；②95℃變性30s，退火溫度分別為56.9℃、55.6℃、61.1℃、54.3℃、50℃、58.8℃、49℃，退火30s，72℃延伸90s，30 個(gè)循環(huán)；③72℃延伸5min；降溫至4℃擴(kuò)增完成。

1.5 核酸電泳及凝膠成像

吸取1μL DNA loading buffer 以及5μL PCR 產(chǎn)物，隨后將其混勻+瓊脂糖凝膠1.0%電泳，最后再把凝膠放置在凝膠成像儀中成像分析，對(duì)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以保存。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

按照遺傳學(xué)基因計(jì)數(shù)方法計(jì)算基因頻率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HPA 基因分型

具體結(jié)果見圖1（以其中的1 號(hào)標(biāo)本為例對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示）。

圖1 HPA 分型結(jié)果

2.2 HPA 基因型以及基因頻率

按照Hardy-Weinberg 定律，分析以上400 例標(biāo)本群體遺傳結(jié)構(gòu)分化、基因頻率與概率、與分化，見表1。

表1 HPA 1-6，15 基因頻率計(jì)算

3 討論

血小板抗原主要分為兩大類：一類是在其他組織或細(xì)胞中也存在的抗原，如紅細(xì)胞的ABO 類抗原和人類組織相容性復(fù)合體HLA-I 類抗原；另一類是人類血小板本身特有的抗原，即血小板特異性抗原[6]。自從1959 年第一個(gè)人類血小板特異性抗原被鑒定以來(lái)，使用人血清免疫性同種抗體鑒定的方法，至今共發(fā)現(xiàn)24 種血小板抗原[7]。其中22 個(gè)抗原被血小板命名委員會(huì)（PNC）正式命名，命名原則以HPA 為字頭連接數(shù)字。在等位基因組成的遺傳統(tǒng)計(jì)中，不同基因型相對(duì)應(yīng)的用小寫英文字母a 和b 分類，a 代表基因頻率大于50%的等位基因，b 代表基因頻率小于50%的等位基因，當(dāng)未發(fā)現(xiàn)等位基因時(shí)，基因型用w 表示。22 個(gè)正式命名的抗原受控于在人類第5、6、17 和22 號(hào)染色體上的6 個(gè)遺傳位置[8]。除HPA14bw基因?yàn)槿笔齻€(gè)堿基的整碼突變，其余遺傳多態(tài)性均為錯(cuò)義突變（SNP）[9]。

HPA 等位基因不管整碼突變還是錯(cuò)義突變，都會(huì)導(dǎo)致所編碼的氨基酸的改變，從而引起膜蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，產(chǎn)生不同的抗原性。

近年來(lái)臨床血小板輸注治療在多種出血性疾病中的廣泛應(yīng)用，使得發(fā)生血小板同種免疫致敏的概率越來(lái)預(yù)高[10]。患者如果要進(jìn)行血小板輸注時(shí)，針對(duì)性的進(jìn)行血小板HPA 基因型檢測(cè)，找與其相適應(yīng)的同型血小板。這樣就能夠有效的避免因血小板抗原性不合造成的輸血不良反應(yīng)[11]。因此，人類血小板抗原的遺傳多態(tài)性的研究對(duì)于指導(dǎo)臨床血小板輸血具有極其重要的意義[12]。

本研究通過(guò)SSP-PCR 技術(shù)對(duì)呂梁地區(qū)漢族人群HPA1-17 進(jìn)行多態(tài)性研究，結(jié)果顯示，HPA 1-6，15呈現(xiàn)多態(tài)性，而在其他位點(diǎn)中只檢出a 基因。此結(jié)果與國(guó)內(nèi)各地區(qū)對(duì)HPA 多態(tài)性研究基本一致[13-14]。

綜上所述，呂梁地區(qū)HPA 基因有其本身的地域特點(diǎn)，此研究將會(huì)為呂梁地區(qū)血小板輸注治療提供幫助。同時(shí)為研發(fā)適用于該地區(qū)的HPA 基因分型檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。