李宜鮮 魏華琳

(1.河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450008；2.河南省口岸食品檢驗檢測所，河南 鄭州 450003)

目前，肺癌作為腫瘤的一種，死亡率已占據(jù)惡性腫瘤首位，研究顯示，5年生存率不到15%[1]?！?017年中國腫瘤登記年報》顯示，肺癌發(fā)病率、病死率已達(dá)我國惡性腫瘤之首[2]。肺癌早期患者難以發(fā)覺，具明顯病癥的患者已至中晚期，目前治療手段主要通過手術(shù)、放化療、靶向療法、生物治療等多種途徑進(jìn)行綜合治療。但對于晚期肺癌患者仍以化療為主，副作用大，部分患者難以承受。因此，尋求療效確切、靶點豐富、副作用低的抗癌藥物迫在眉睫[3-4]。山豆根是豆科植物越南槐 (VietnamesesophoraRoot) 的干燥根及根莖。可具清熱解毒，消腫止痛之功，為臨床常用藥,具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌、鎮(zhèn)痛抗炎、抗肝損傷、抗氧化及增強(qiáng)免疫等多種藥理作用?；瘜W(xué)成分上主要含有機(jī)酸、生物堿、黃酮、三萜及多糖等[5]。研究表明,山豆根水提液對人食管道癌Eca-109 細(xì)胞及肝癌SMMC-7721細(xì)胞均有抑制作用，體內(nèi)能夠抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長,顯著延長小鼠的生存期和生存質(zhì)量[6-7]。張奇峰[8]通過開展體外抗腫瘤實驗，發(fā)現(xiàn)山豆根水提取物對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞有抑制作用?？梢娚蕉垢哂幸欢鼓[瘤作用。近年來，有研究者對山豆根醇提物逐步開展相應(yīng)研究，藥理作用范圍也在不斷擴(kuò)大化，如柯友輝等通過實驗發(fā)現(xiàn)山豆根醇提物抑制TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制增生性瘢痕的療效[9]。本研究采用乙醇提取物為研究對象，建立Lewis肺癌小鼠模型，觀察山豆根醇提物對Lewis肺癌小鼠的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用，為進(jìn)一步開拓山豆根藥理作用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1藥物 山豆根乙醇提取物，南京澤郎生物科技有限公司。提取方法：山豆根(曬干)置干燥箱中60 ℃干燥后粉碎成粗粉。精密稱定約50 g,置于1 L的圓底燒瓶中,以7倍量95%乙醇為提取溶劑,回流提取3次,合并濾液,回收溶劑,濃縮成浸膏，浸膏用0.5%CMC-Na溶液配制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL，20 mg/mL，10 mg/mL備用。順鉑(DDP)，江蘇恒瑞，批號：20180706；

1.2瘤株及動物 Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer cell, LLC)，上海弘順生物科技有限公司；SPF級6-8周齡C57BL/6J小鼠85只，雌雄各半，單位：濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯)20190003。

1.3試劑與儀器 白介素-2(IL-2)；白介素-10(IL-10)；白介素-6(IL-6)；內(nèi)皮抑素(ES)；血管抑素(AS)；腫瘤壞死因子(TNF-α)；干擾素-γ(TFN-γ)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)試劑盒。批號依次為：E20181115A、E20181028A、E20181120A、E20181113A、E20181109A、E20181205A、E20180927A、E20181209A、E20181118A、E20181027A，蘇州卡爾文生物科技有限公司。PBS緩沖液；HyClone High Glucose DMEM；胎牛血清；胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀，型號：H1850R；全自動生化分析儀，型號：BS-490，武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞采用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞傳代，胰蛋白酶消化，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.2建模給藥[10-11]實驗動物正常喂養(yǎng)7天，稱重，根據(jù)動物體重值將動物隨機(jī)分為空白組、模型組、順鉑組、山豆根乙醇提取物高劑量組、山豆根乙醇提取物中劑量組、山豆根乙醇提取物低劑量組，每組13只。各組動物除空白組外分別于右腋皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液，每只0.2 mL(細(xì)胞計數(shù)器選取活細(xì)胞數(shù)>95%，濃度為1×107/mL)，接種后7 d，選取造模動物右腋下形成瘤塊者為成模動物，最終動物實驗數(shù)確定為每組10只(確保每組成模動物數(shù)量統(tǒng)一)。各組動物給予相應(yīng)藥物，順鉑組腹腔注射DDP6 mg/kg，隔日一次，山豆根乙醇提取物高劑量組(灌胃劑量400 mg/kg)、山豆根乙醇提取物中劑量(灌胃劑量200 mg/kg)、山豆根乙醇提取物低劑量(灌胃劑量100 mg/kg)，小鼠灌胃體積均為0.1 mL/10g，其中空白組及模型組給予同等體積生理鹽水，每d1次，連續(xù)21 d。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1血清指標(biāo)檢測 各組動物于末次給藥2h后，10%水合氯醛(0.1 ml/10g)進(jìn)行腹腔注射麻醉，腹主動脈插管取血，15 min，3500 r/min離心，取上清液，酶聯(lián)免疫Elisa法測定血清中白蛋白、IL-2、IL-10、IL-6、TNF-α、AS、ES、TFN-γ、VEGF、HIF-1α、MMP-2含量。

1.5.2臟器指數(shù)及腫瘤抑制率檢測 各組動物取胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)；取出瘤塊，稱重，計算腫瘤抑制率(抑制率=模型組瘤塊平均重量-給藥組瘤塊平均重量/模型組瘤塊平均重量)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以的形式表示，運(yùn)用單因素方差對各組間對比，依照方差齊性進(jìn)行LSD法及Games-Howell法選擇，以p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1對Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響 與空白組對比，模型組腫瘤形成，瘤體質(zhì)量逐漸增加，模型復(fù)制成功，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；與模型組比較，順鉑組、山豆根乙醇提取物高、中、低劑量組均可不同程度降低模型動物瘤體質(zhì)量，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。見表1。

表 1 對Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響

2.2對Lewis肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、IL-6、TNF-α含量的影響 與空白組比較，模型組動物血清中IL-10、IL-6含量明顯升高，而IL-2、TNF-α含量顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；與模型組比較，順鉑組、山豆根乙醇提取物高、中、低劑量組均可不同程度升高模型動物血清中IL-2、TNF-α含量，降低IL-10、IL-6含量，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。見表2。

表 2 對Lewis肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、IL-6、TNF-α含量的影響

2.3對Lewis肺癌小鼠血清AS、ES、TFN-γ含量的影響 與空白組比較，模型組動物血清中AS、ES、TFN-γ含量均有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；與模型組比較，順鉑組、山豆根乙醇提取物高、中、低劑量組均可不同程度升高模型動物血清中AS、ES、TFN-γ含量，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。見表3。

表 3 對Lewis肺癌小鼠血清AS、ES、TFN-γ含量的影響

2.4對Lewis肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影響 與空白組比較，模型組動物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2含量有所升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；與模型組比較，順鉑組、山豆根乙醇提取物高、中、低劑量組均可不同程度降低模型動物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2含量，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。見表4。

表 4 對Lewis肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影響

3 討論

肺癌作為臨床高發(fā)癌腫，主要依據(jù)瘤體細(xì)胞分化、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移程度對肺癌進(jìn)行分類。其中非小細(xì)胞肺癌可分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。已達(dá)肺癌晚期患者，通暢已失去最佳手術(shù)機(jī)會進(jìn)而轉(zhuǎn)向化療手段，但傳統(tǒng)化療常存在不同程度耐藥現(xiàn)象，使得化療療效不斷降低，機(jī)體免疫能力逐漸降低[12]。

干擾素-γ(IFN-γ)是體內(nèi)參與免疫反應(yīng)的重要活性因子，主要由巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞進(jìn)行分泌增殖。同樣，腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌也依賴巨噬細(xì)胞與活化T細(xì)胞，主要參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程，TNF-α使血管豐富的腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的壞死和生長抑制，并參與機(jī)體的炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答，具有抗腫瘤作用[13]。白介素-2(IL-2)對細(xì)胞因子、干擾素成分可發(fā)揮誘導(dǎo)作用，對免疫調(diào)節(jié)有重要的作用，促進(jìn) Fas抗原表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。白介素-6(IL-6)是一種由多種細(xì)胞分泌的、在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子, 具有促進(jìn)多種細(xì)胞生長的作用, 也具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。目前研究已證實IL-6在體外可誘導(dǎo)腫瘤增殖功能。IL-6、IL-8對結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肺癌等均有不同程度的誘導(dǎo)效應(yīng)[14]。白介素-10(IL-10)是一種作用比較強(qiáng)的多向性免疫抑制因子，對多種因子均可產(chǎn)生抑制作用，如單核細(xì)胞因子、Th1細(xì)胞因子均產(chǎn)生抑制作用，在體內(nèi)主要由Th2細(xì)胞和癌細(xì)胞分泌。但I(xiàn)L-10對B細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對Th1和Th2類T細(xì)胞之間具有一定介導(dǎo)作用。目前，針對腫瘤免疫治療新的途徑主要是促使腫瘤細(xì)胞由Th2向Th1逆轉(zhuǎn)。TFN-γ由T細(xì)胞分泌，在機(jī)體受到腫瘤組織侵襲時，T細(xì)胞受到刺激后，TFN-γ被大量分泌進(jìn)入血液中，參與免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用[15-16]。本次實驗顯示，模型組動物血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2含量低于空白組，IL-10、IL-6含量高于空白組，可知模型組動物機(jī)體免疫能力下降，腫瘤組織增生轉(zhuǎn)移，經(jīng)山豆根乙醇提取物干預(yù)后得到明顯改善，可知山豆根乙醇提取物可有效活化T細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞由Th2向Th1逆轉(zhuǎn)，有效抑制腫瘤組織增殖轉(zhuǎn)移。

缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF-1α) 可反應(yīng)組織內(nèi)含氧量，研究顯示，在眾多腫瘤組織機(jī)體內(nèi)存在高表達(dá)狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞可適應(yīng)缺氧環(huán)境主要依靠HIF-1α的誘導(dǎo)作用，促使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境相關(guān)的基因表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞血管生成及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮至關(guān)重要作用[17]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作為內(nèi)肽酶家族中的一，是Zn2+依賴型的蛋白酶，能促進(jìn)腫瘤組織的侵襲和遷移，主要通過降解細(xì)胞外機(jī)制(ECM)的成分組成發(fā)揮作用。其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)尤為重要[18]。內(nèi)皮抑素(ES)及血管抑素(AS)是抑制腫瘤血管生成的重要因子，AS抑制血管生成機(jī)制主要與抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移有關(guān)，而ES主要通過抑制新的腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究證實，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在臨床眾多癌癥患者機(jī)體內(nèi)存在高表達(dá)趨勢，如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等，可有效反應(yīng)藥物對腫瘤組織的治療效果，具有潛在應(yīng)用價值;與預(yù)后和一些肺癌患者的治療反應(yīng)相關(guān)[19-20]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，模型動物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2含量明顯高于空白組，AS、ES含量明顯低于空白組，經(jīng)山豆根乙醇提取物干預(yù)后得到明顯改善，可知山豆根乙醇提取物可有效抑制腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境相關(guān)的基因表達(dá)，抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，山豆根乙醇提取物各劑量均明顯降低模型動物血清中IL-10、IL-6、VEGF、HIF-1α、MMP-2含量，升高IL-2、TNF-α、AS、ES、TFN-γ含量。通過實驗可推測，山豆根乙醇提取物防治肺癌機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及抑制腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移來抑制血管生成有關(guān)。但本研究在數(shù)據(jù)及指標(biāo)選取方面稍顯不足，未能明確山豆根中抗癌具體單體成分，后期需對醇提物中單體成分進(jìn)行逐步研究，確定抗癌單體成分，增加研究數(shù)據(jù)，深入分子水平為臨床防治肺癌提供一定用藥依據(jù)。