任燕 羅春麗 蔣雯文 黃明進 謝丹

(貴州大學，貴州 貴陽 550025)

白術RhizomaAtractylodisMacrocephalae能益氣健脾且燥濕，是一種對不明原因腸炎有效的傳統(tǒng)中藥，β-桉葉醇是白術中一種活性成分。為了證實β-桉葉醇具有修復腸膜的功效，本文選取IEC-6細胞作為實驗對象，IEC-6細胞是胃腸粘膜修復藥理實驗的適宜細胞模型[1]，腸上皮細胞IEC-6細胞來源于大鼠小腸隱窩細胞，是腸道屏障的關鍵組成部分，具有阻止抗原、毒素和有害微生物從腸腔轉移到循環(huán)中的作用[2-3]。IEC-6細胞常用于體外建立胃腸粘膜損傷修復模型[4]。本研究我們假設β-桉葉醇可能通過多胺介導的信號通路調節(jié)Ca2+，從而調節(jié)IEC-6的增殖和遷移，為β-桉葉醇胃腸黏膜損傷修復作用機制研究提供參考。為了證實這一假設，我們采用MTT法、劃痕法、流式細胞術及蛋白印跡法等研究β-桉葉醇對IEC-6細胞增殖和遷移的影響，通過檢測細胞內ODC和Ca2+濃度、TRPC1mRNA和蛋白的表達，以及對細胞周期的影響探討β-桉葉醇對胃腸粘膜損傷的修復作用的可能機制。

1 實驗材料

1.1細胞系 IEC-6細胞系，購自中國模式培養(yǎng)收集中心(CCTCC)。

1.2試劑 β-桉葉醇(10 mg，批號：ZT-70925)購于中國四川省藥檢所；RPM 1640培養(yǎng)基(美國圣路易斯Sigma化工公司)；0.25%胰蛋白酶/EDTA；雙抗；胰蛋白酶(美國大島Gibco Life Technologies)；胎牛血清(中國蘭州民海生物科技有限公司)；MTT和DMSO(Sigma Chemical Co.)；TNF-α及ODC酶聯免疫吸附試劑盒(上海甄準生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)；PBS緩沖液；甲氨蝶呤(MTX)；EB(溴化乙錠)。

2 實驗方法

2.1對IEC-6細胞增殖的影響 培養(yǎng)細胞是在37℃的含5%CO2的加濕空氣中進行。在RPM 1640培養(yǎng)基中添加10%熱滅活胎牛血清(FBS)和慶大霉素。取對數生長期的細胞，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液；用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，調節(jié)細胞密度5×104mL，100 μL/孔接種于96孔板中，每組設置6個重復，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別將已稀釋的不同濃度(0 mol·L-1、10 mol·L-1、20 mol·L-1、40 mol·L-1、80 mol·L-1、160 mol·L-1)的 β-桉葉醇(無血清培養(yǎng)基配藥)加入各相應孔中，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，每孔加入200μL終濃度為0.5 mg·mL的MTT溶液；并輕輕晃動培養(yǎng)板數次，37℃，5% CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸棄液體，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，用酶標儀測定其在492 nm處的吸光度值。用以下公式計算細胞增殖率：增殖率(%)=[1-A492 nm(處理細胞)/A492 nm(對照細胞)]×100%。

2.2對IEC-6細胞增殖的影響 取對數生長期的細胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液；用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，調節(jié)細胞密度1×105mL，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設置3個重復，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將實驗組分為2組(β-桉葉醇組和空白對照組)，分別加入相應的藥物成分，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細胞2次，終止消化，將細胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌2次，吸除上清液，用于ELISA檢測ODC。

2.3對IEC-6細胞內Ca2+濃度的影響 細胞培養(yǎng)同上，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液；用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，調節(jié)細胞密度1×105mL，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設置3個重復，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將實驗組分為2組(β-桉葉醇組和空白對照組)，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細胞2次，終止消化，將細胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm×5 min離心，吸除上清液，采用不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks緩沖液洗滌2次，吸除上清，然后加入適量含有fluo-3/AM的D-Hanks緩沖液(fluo-3/AM終濃度為1μM)，置于37℃避光孵育30 min，用-Hanks緩沖液輕洗2次，再加入D-Hanks緩沖液，37℃，繼續(xù)孵育20 min，將每個樣品移入流式細胞儀反應杯，用流式細胞儀測定細胞內Ca2+含量。

2.4對IEC-6細胞各組間沖溝距離的影響 用PBS清除對數生長的IEC-6細胞，胰蛋白酶消化，吸入15 mL塑料離心管，1000 rpm×5 min離心，吹打成單細胞懸液。用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，將細胞密度調至2×105mL-1，接種于6孔板中，6孔培養(yǎng)板背面每隔0.5 cm劃橫線，然后將6孔培養(yǎng)板置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待貼壁細胞后，取上清液，用200 μL移液管吹掃垂直溝道，用PBS清洗兩次，清除脫落細胞，取對數生長期的細胞， PBS洗滌，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液；用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，調節(jié)細胞密度2×105mL-1，2 mL/孔接種于6孔板中，6孔板背面提前用馬克筆每隔0.5 cm劃線，每孔至少5條線，每組設置3個重復，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞長至單層，吸除上清液，使用200 μL槍頭比著直尺，垂直于背后橫線劃痕，用PBS洗滌2次，去除劃下細胞，加入β-桉葉醇和2%FBS，放入孵箱，在100 μx0005 μ顯微鏡下拍攝，隨機取5個場，于0 h、24 h拍照。利用PS軟件和motic軟件計算各間溝間距離。

2.5對IEC-6細胞周期的影響 取對數生長期的細胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液；用血球計數板對該單細胞懸液所含細胞進行計數，調節(jié)細胞密度1.3×105mL-1，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設置3個重復，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將實驗組分為2組(β-桉葉醇組和空白對照組)，分別加入相應的藥物成分，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細胞2次，用細胞上清液終止消化，將細胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌2次，吸除上清液，加入500 μL體積分數為70%的冷乙醇，4℃固定過夜；27000 rpm離心5 min，吸棄上清，用PBS洗滌2次，加入配制好的500 μL PI/RNase A 染色工作液(臨用時將 Rnase A：PI 工作液按 1：9 體積配制)，室溫避光 30 min后，用流式細胞儀分析結合量。

2.6對細胞TRPC1蛋白基因表達的影響 細胞培養(yǎng)同上，收集細胞離心，將細胞重新懸浮在1毫升的PBS中，分成4個微管離心。去除上清液，洗滌細胞兩次，后向每管加入RIPA 裂解液，置碎冰上裂解10 min；收集裂解液，4℃，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。并將細胞裂解液與5個SDS-PAGE加載緩沖液混合。將等量的蛋白質在95℃下加熱10分鐘，然后在預制的7-15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上分離。將蛋白質電轉移到硝酸纖維素膜中，該膜在Tris緩沖鹽水加含5%脫脂奶粉的0.05%吐溫-20(TBS-T)中封閉1 h。將膜在TBS-T中洗滌，并在含1%脫脂牛奶的TBS-T中與原代單克隆抗體在4℃下孵育過夜。將PVDF膜放入一抗中，4℃孵育過夜；用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min；后將PVDF膜放入二抗中，室溫孵育2-3 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次10 min。將PVDF膜平鋪到保鮮膜上，將ECL發(fā)光液的A、B兩種試劑等體積混合后，均勻的滴加到膜上，反應1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入暗室中，曝光，用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析，結果以目的蛋白相對表達量表示。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內參積分光密度值(IOD)，各樣本蛋白質水平與GAPDH相關。

2.7對細胞TRPC1蛋白基因表達的影響 細胞培養(yǎng)同上，收集細胞，離心，將顆粒重新懸浮在PBS中，分成4個微管離心。將上清液丟棄。從每個樣本中提取總RNA，然后使用定量PCR(QPCR)cDNA動物總RNA分離試劑盒將等量RNA反向轉錄成cDNA。從美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中搜索基因全序列，使用Primer Premier引物設計軟件設計篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE純化。所有引物在使用前須檢查一個擴增產物。將樣品在95℃下加熱10 min，然后熔化，退火。以GAPDH為參考基因，利用Microsoft Excel軟件對實時數據進行采集和分析。在標準的基礎上，通過相對定量計算拷貝數。

3 結果

3.1β-桉葉醇對IEC-6細胞增殖的影響 MTT結果顯示，與空白組相比，β-桉葉醇濃度在80 μm、160 μm的細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，增殖率均無顯著性差異(p>0.05)。在10 μm、40 μm(24 h)、10 μm、20 μm(48 h)、10 μm、20 μm(72 h)(p<0.05)上有差異，與空白組比較，β-桉葉醇的20 μm(24 h)濃度有顯著差異(p<0.01)，結果見表1。

表 1 β-桉葉醇對IEC-6 細胞增殖影響(OD值及增殖率)

3.2β-桉葉醇對IEC-6細胞內ODC含量的影響 ELISA實驗結果顯示，與空白組比較，IEC-6細胞中ODC濃度β-桉葉醇組(20μm，24 h)有顯著性差異(p<0.01)。見表2。

3.3β-桉葉醇對IEC-6細胞內Ca2+濃度的影響結果表明與空白組比較，β-桉葉醇組(20 μm，24 h)有顯著性差異(p<0.05)。各組IEC6細胞內Ca2+濃度見表2。

3.4β-桉葉醇對IEC-6細胞各組間沖溝距離的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，與0 h相比，β-桉葉醇組(20μM，24 h)有顯著性差異(p<0.05)，空白組(24 h)與0 h相比無顯著性差異(p<0.05)。各組沖溝距離見表2。

表 2 IEC-6細胞內ODC含量

3.5β-桉葉醇對IEC-6細胞周期的影響 結果表明β-桉葉醇組在G1期的OD值明顯高于空白組(p<0.01)，S期β-桉葉醇組OD值明顯低于空白組，數據見表3。

表 3 β-桉葉醇對細胞周期的影響(OD值)

3.6β-桉葉醇對細胞TRPC1蛋白基因表達的影響(Western blot) Western blotting和PCR分析顯示(圖1)在IEC6細胞中，β-桉葉醇組TRPC1的表達明顯高于空白組(p<0.05)，結果見表4。

表 4 TRPC1蛋白基因表達值

圖1 β-桉葉醇對ICE-6細胞TRPC1蛋白基因表達影響的Western印跡結果

4 討論

本論文研究了β-桉葉醇對IEC-6細胞增殖和遷移的影響。體外MTT結果表明β-桉葉醇處理的IEC-6細胞增殖率明顯高于空白組，如表1所示；ELISA實驗結果表明，與空白對照組相比，β-桉葉醇處理的IEC-6細胞中ODC濃度高于空白對照組，如表2所示；采用流式細胞儀分析顯示細胞內鈣離子的含量，結果顯示β-桉葉醇組明顯高于空白組，如表3所示。劃痕實驗結果表明β-桉葉醇能快速刺激損傷后IEC-6細胞遷移，對細胞遷移的促進作用明顯，如表4所示；采用流式細胞技術研究細胞周期，結果表明，與空白對照組相比，β-桉葉醇(10mol·L-1)處理的IEC-6細胞具有更多的二倍體，在細胞復制中起重要作用，如表5所示；Western blot實驗和RT-PCR實驗結果表明TRPC1蛋白在β-桉葉醇組中的表達明顯高于空白對照組，如表6和表7所示。

鳥氨酸脫羧酶(ODC)是多胺生物合成的限速酶，介導上皮細胞增殖，在胃粘膜損傷的最佳修復中發(fā)揮關鍵作用。精胺、亞精胺、腐胺等多胺可介導胃腸道細胞的生長和分化，并在胃十二指腸粘膜損傷的最佳修復中發(fā)揮重要作用[5]。ODC調節(jié)多胺的生物合成，它在胃腸道的細胞生長和分化中起著重要的作用，從而促進損傷后的修復[6-7]，在高滲氯化鈉給藥后胃粘膜愈合等條件下，ODC活性增加[8]，當細胞內多胺增加時，Kv1.1通道被激活，導致細胞膜電位超極化。研究表明，腸上皮細胞Kv1.1通道的表達依賴于多胺的調節(jié)[9-12]，細胞膜電位的超極化可增強鈣離子內流[13-14]，多胺的增加可以增加Ca2+的驅動力，Ca2+通過激活Kv通道而侵入[12]，因此增加[Ca2+]cyt，[Ca2+]cyt的增加可促進細胞遷移，這解釋了較高濃度的ODC在β-桉葉醇處理的細胞中可增加細胞中Ca2+的濃度，同時也解釋了β-桉葉醇促進細胞增殖和遷移，并與影響細胞內多胺合成和細胞內[Ca2+]cyt濃度的增加。TRPC1是調節(jié)鈣池的鈣通道之一，TRPC1介導的CCE(由于儲存耗竭引起的鈣離子進入稱為電容性鈣離子進入)是[Ca2+]cyt的重要來源，調節(jié)粘膜損傷的早期修復[15]，[Ca2+]cyt可刺激細胞遷移并促進早期修復過程。由于非興奮性細胞不表達VDCC(一種有效的電壓依賴性鈣通道)，[Ca2+]Cyt細胞的增加主要依賴于離子跨膜通道和細胞內鈣庫介導的Ca2+內流的釋放[16,17]。如果[Ca2+]cyt減少，細胞遷移將受到抑制[18-20]；當細胞受到相應的刺激時，細胞內游離Ca2+離子濃度增加，[Ca2+]Cyt的相應增加在激活細胞分化、增殖、遷移、蛋白質分泌和免疫應答等生理過程中起著重要的觸發(fā)和第二信使作用[21]。維持細胞遷移需要穩(wěn)定升高的[Ca2+]Cyt，這主要取決于細胞外Ca2+的流入。細胞周期[Ca2+]cyt的增加與TRPC1mRNA和蛋白的高表達有關。在分化的腸上皮細胞中，TRPC1mRNA和蛋白質的表達顯著高于非分化細胞[22]。CAV1蛋白也可以通過激活TRPC-1介導的Ca2+流入促進粘膜損傷后修復[23]。因此，在腸上皮細胞中，TRPC1具有SOCs(細胞因子信號抑制物)的功能，可受CCE調節(jié)，[Ca2+]cyt在損傷后腸粘膜上皮的修復中起重要作用，TRPC-l還可通過與STIMIL、RShOA等蛋白質相互作用影響細胞遷移[24,25]。

本研究結果表明，β-桉葉醇能促進腸上皮細胞的增殖和遷移，β-桉葉醇能促進TRPC1mRNA和蛋白表達，增強TRPC1介導的細胞內Ca2+，提高[Ca2+]Cyt的濃度，而Ca2+在上皮細胞增殖和遷移中發(fā)揮著重要作用[20]，促進粘膜損傷后修復[23]提示β-桉葉醇是通過促進腸上皮細胞增殖和遷移而促進損傷后IEC-6細胞的修復，因此，β-桉葉醇可能通過增強TRPC1介導的細胞內Ca2+含量，在粘膜損傷修復中發(fā)揮重要作用增加細胞多胺合成，增加TRPC1 mRNA和蛋白表達，增加Ca2+流入，從而增加[Ca2+]Cyt，促進細胞增殖和遷移，這可能是β-桉葉醇促進腸黏膜損傷修復的機制之一，本實驗除了證實β-桉葉醇對腸黏膜的修復作用外，還部分解釋了β-桉葉醇修復腸黏膜的機制。