黃建猷，胡筱希，黃周鋒，陸國(guó)壽，譚 曉，藍(lán)常珍

基于化學(xué)模式識(shí)別法的翼核果指紋圖譜及抗氧化活性研究

黃建猷1, 2，胡筱希1#，黃周鋒1, 2，陸國(guó)壽1, 2*，譚 曉1，藍(lán)常珍3

1. 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022 2. 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022 3. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021

基于化學(xué)模式識(shí)別法建立翼核果指紋圖譜與多成分含量測(cè)定，并研究其抗氧化活性，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。建立15批不同產(chǎn)地翼核果HPLC指紋圖譜，確定共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)4種化學(xué)成分并測(cè)定樣品中含量，使用SPSS 19.0、SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析，DPPH法測(cè)定其抗氧化活性，并通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析建立其譜效關(guān)系。選取了8個(gè)色譜峰作為指紋圖譜的共有峰，通過(guò)聚類(lèi)分析可將15批翼核果分為3類(lèi)，主成分分析與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致；經(jīng)主成分分析，3個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為80.505%；被指認(rèn)的大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰在15批樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.06～2.08 mg/g、3.57～17.03 mg/g、0.04～1.53 mg/g、0.10～1.59 mg/g；15批樣品均具有抗氧化活性，8個(gè)共有峰與抗氧化活性存在一定的關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度在0.8259～0.6351，各特征峰所代表的化學(xué)成分對(duì)其抗氧化活性貢獻(xiàn)的大小順序?yàn)?號(hào)峰＞3號(hào)峰＞1號(hào)峰＞2號(hào)峰＞4號(hào)峰＞5號(hào)峰＞7號(hào)峰＞6號(hào)峰。翼核果抗氧化作用為“多成分”共同起效的結(jié)果，翼核果指紋圖譜的構(gòu)建和化學(xué)模式識(shí)別為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚可作為翼核果質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

翼核果；指紋圖譜；大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；抗氧化活性；化學(xué)模式識(shí)別；灰色關(guān)聯(lián)分析

在廣西傳統(tǒng)瑤藥中，最具代表性和民族特色的是民間傳統(tǒng)使用的“五虎”“九?！薄笆算@”“七十二風(fēng)”藥材[1]，“九?！卑ò拙排！⒓t九牛、花九牛、青九牛、黃九牛、黑九牛、紫九牛、藍(lán)九牛[2]。翼核果又名紫九牛，為鼠李科（Rhamnaceae）植物翼核果Benth.的根、莖及葉，收載于《中國(guó)瑤藥學(xué)》[3]、《中國(guó)壯藥學(xué)》[4]等，別名血風(fēng)根、血風(fēng)藤、紅蛇根、青筋藤、鐵牛入石、拉牛入石；瑤醫(yī)認(rèn)為其具有養(yǎng)血祛風(fēng)、舒筋活絡(luò)、固腎益精等功效；用于治療貧血頭暈、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、慢性肝炎、肝硬化、風(fēng)濕筋骨疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、四肢麻木、神經(jīng)痛、跌打損傷、內(nèi)傷等疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，翼核果中含有生物堿、黃酮苷、蒽醌等化學(xué)成分[5-9]，翼核果醇提物毒性低，對(duì)乙醇肝損傷有防治作用[10]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)翼核果的質(zhì)量控制研究多以薄層色譜（TLC）[11]、HPLC及其指紋圖譜[12-16]等指標(biāo)性成分進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，但這些研究以單純的化學(xué)分析為主，而與藥效結(jié)合的整體性、聯(lián)系性探索較少，也未見(jiàn)對(duì)翼核果HPLC指紋圖譜與其活性相關(guān)性的報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)建立了不同產(chǎn)地翼核果的指紋圖譜及對(duì)大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種成分進(jìn)行了含量測(cè)定，應(yīng)用聚類(lèi)分析與主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別法對(duì)不同產(chǎn)地翼核果藥材進(jìn)行比較分析；通過(guò)DPPH法測(cè)定其抗氧化活性，并利用灰色關(guān)聯(lián)度分析其特征峰與抗氧化活性的關(guān)系，為能更好地開(kāi)發(fā)利用翼核果藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3色譜工作站，美國(guó)Waters公司）；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KS-3200DE液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品：大黃素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-201913）；大黃酚（自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）；大黃素甲醚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110758-201817）；大黃素- 8--β--吡喃葡萄糖苷（成都瑞芬生物科技有限公司，批號(hào)D-018-180802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）。磷酸（廣東光華科技股份有限公司，分析純），甲醇（廣東光華科技股份有限公司，分析純），乙腈（默克股份兩合公司，色譜純），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Milipore公司）。

1.3 藥材

翼核果分別收集于不同地點(diǎn)，見(jiàn)表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院盧文杰主任藥師鑒定為鼠李科（Rhamnaceae）植物翼核果Benth.的根、莖及葉。

表1 15批翼核果藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取大黃素- 8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為27.20、40.08、29.36、21.84 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取翼核果藥材（粉碎，過(guò)40目篩）0.2 g至25 mL量瓶中，加入20 mL甲醇超聲30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

Waters SunFire?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～40 min，85%～75% A；40～60 min，75%～65% A；60～80 min，65% A；80～100 min，65%～50% A；100～120 min，50%～30% A；120～130 min，30%～10% A；130～135 min，10%～85% A；135～145 min，85% A）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批翼核果粉末（S1）約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以5號(hào)峰（大黃素）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批翼核果粉末（S1）約0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、3、6、12、18、24 h后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以5號(hào)峰（大黃素）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批翼核果粉末（S1）約0.2 g，精密稱(chēng)定，平行制備6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以5號(hào)峰（大黃素）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰的標(biāo)定 取15批不同產(chǎn)地翼核果粉末，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到15批翼核果藥材HPLC圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）進(jìn)行色譜峰匹配，樣品（S1）圖譜作為參照?qǐng)D譜，共標(biāo)定8個(gè)色譜峰，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），采用多點(diǎn)校正建立指紋圖譜，見(jiàn)圖1、2。

圖1 15批翼核果藥材HPLC指紋圖譜

圖2 翼核果藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜

2.4.2 相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間 選取峰面積較大，出峰時(shí)間較穩(wěn)定的5號(hào)峰（大黃素）作為參照峰（S）。取15批翼核果指紋圖譜計(jì)算各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一色譜圖中S峰的保留時(shí)間和峰面積的比值，得到的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2、3。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.0%，說(shuō)明共有峰出峰時(shí)間均較穩(wěn)定，成分種類(lèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.4.3 相似度 將得到的15批翼核果指紋圖譜導(dǎo)入的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，進(jìn)行色譜峰匹配，生成翼核果對(duì)照指紋圖譜（圖2），并計(jì)算不同批次之間的相似度。結(jié)果顯示，15批樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度分別為0.782、0.978、0.973、0.921、0.930、0.947、0.954、0.856、0.965、0.616、0.917、0.608、0.426、0.198、0.875。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地樣品存在較大差異。

表2 15批翼核果指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 15批翼核果指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

2.4.4 主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn) 采用對(duì)照品對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄HPLC圖，通過(guò)比較各峰保留時(shí)間和紫外吸收光譜，對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)（圖3）。翼核果樣品HPLC指紋圖譜中2、5、6、8號(hào)峰得到化學(xué)指認(rèn)，依次為大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。

2-大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 5-大黃素 6-大黃酚 8-大黃素甲醚

2.5 HPLC同時(shí)測(cè)定翼核果中4種有效成分的含量

2.5.1 色譜條件 同“2.2”項(xiàng)色譜條件。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取大黃素- 8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制成含大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷340.00 μg/mL、大黃素501.00 μg/mL、大黃酚367.00 μg/mL、大黃素甲醚273.00 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別取各對(duì)照品溶液5 mL至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，然后分別取混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，均定容至10 mL，得到不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)下方法。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)每個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照進(jìn)行測(cè)定并記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線(xiàn)性回歸，即得回歸方程及線(xiàn)性范圍。回歸方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)分別為大黃素- 8--β--吡喃葡萄糖苷＝37 437＋10 234.2，6.80～68.00 μg/mL，2＝0.999 8；大黃素＝18 331－5 852.5，10.02～100.20 μg/mL，2＝0.999 9；大黃酚＝16 108－2 128.6，7.34～73.40 μg/mL，2＝0.999 5；大黃素甲醚＝16 082－291.8，5.46～54.60 μg/mL，2＝0.999 8；結(jié)果表明4種成分在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液在“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.56%、0.38%、0.43%、0.52%，表明儀器的精密性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1批翼核果藥材，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、3、6、12、18、24 h后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.89%、0.96%、1.43%、1.25%。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1批翼核果藥材，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為1.62%、1.57%、1.48%、1.55%。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已測(cè)定的翼核果粉末（S1）6份，每份0.1 g，加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為98.33%、100.89%、97.84%、101.67%，RSD值分別為1.82%、1.66%、1.48%、1.75%。

2.5.9 樣品測(cè)定 取15批翼核果藥材按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備2份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 聚類(lèi)分析 將15批翼核果樣品各共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，采用Ward法，平方Euclidean距離聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，當(dāng)分類(lèi)距離為5時(shí)，15批樣品可分為3類(lèi)，第I類(lèi)S1～S10、S14，第II類(lèi)S12、S13，第III類(lèi)S11、S15。

2.6.2 主成分分析（PCA） 為評(píng)價(jià)所有成分的樣品分辨能力，運(yùn)用SIMCA 14.1分析軟件對(duì)其進(jìn)行PCA結(jié)果見(jiàn)圖5，由PCA圖可以看出，S1～S10、S13～S14聚為一類(lèi)；S12為一類(lèi)；S11、S15聚為一類(lèi)，結(jié)果與聚類(lèi)分析的結(jié)果基本一致，樣品之間的離散程度較大，表明樣品差異性較大[17-18]。

表4 15批翼核果多成分含量測(cè)定結(jié)果(n＝2)

圖4 15批翼核果聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

圖5 翼核果PCA圖

采用SPSS 19.0 進(jìn)行主成分因子分析，相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表5，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，得到前3個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為80.505%＞80%。故可采用前3個(gè)主成分因子為指標(biāo)對(duì)15批翼核果樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表5 3個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

2.7 DPPH法測(cè)定抗氧化活性

2.7.1 溶液配制 精密稱(chēng)取DPPH適量，加無(wú)水乙醇配制成0.05 mg/mL溶液，避光保存。

2.7.2 DPPH自由基清除作用 參考文獻(xiàn)方法[19]，按“2.1.2”項(xiàng)下方法提取樣品，甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度（相當(dāng)于生藥量）的供試品溶液。取供試品溶液20 μL與180 μL DPPH溶液置于96孔板上，得樣品組；取供試品溶液20 μL與180 μL無(wú)水乙醇置于96孔板上，得對(duì)照組；取無(wú)水乙醇20 μL，與180 μL DPPH溶液置于96孔板上，得空白組。上述樣品組和對(duì)照組設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)3復(fù)孔；空白組也同時(shí)設(shè)3復(fù)孔。振蕩充分混勻后，避光條件下反應(yīng)1 h，使用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，各質(zhì)量濃度下的吸光度（）取平均值。按下式計(jì)算自由基清除率。

自由基清除率＝1?(A?A)/A

A為樣品組的；A為對(duì)照組的；A為空白組的。

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件作logistic回歸分析，計(jì)算得到半數(shù)清除濃度（IC50），結(jié)果見(jiàn)表6。各樣品IC50的大小依次為S7＞S10＞S4＞S5＞S12＞S9＞S8＞S2＞S14＞S3＞S11＞S6＞S1＞S15＞S13。由此可知，S13樣品在本實(shí)驗(yàn)組中DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，即抗氧化能力最強(qiáng)。

2.8 翼核果HPLC圖譜與抗氧化活性的灰色關(guān)聯(lián)分析[20-21]

2.8.1 原始數(shù)據(jù)的無(wú)量綱化處理 原始數(shù)據(jù)的變換采用初值化變換法。變換的母序列記為{0()}，子序列記為{X()}，將翼核果不同批次抗氧化活性的藥效指標(biāo)作為母序列，翼核果不同批次的共有峰峰面積作為子序列。

表6 15批樣品抗氧化活性

2.8.2 絕對(duì)差序列及關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 在=時(shí)（為峰號(hào)），母序列記為{X()}，子序列記為{X()}，母序列與子序列的絕對(duì)差序列D0i()=|0()－X()|(1≤≤)。計(jì)算在時(shí)母序列與子序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)()。

()=[minmin|0()－Y()|＋maxmax|0()－Y()|]/ [|0()－Y()|＋maxmax|0()－Y()|]

Y()為翼核果不同批次抗氧化活性的藥效指標(biāo)；Y()為不同批次翼核果特征峰面積歸一化數(shù)值；為峰號(hào)；為分辨系數(shù)，作用是削弱最大絕對(duì)差數(shù)值的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的顯著性差異?（0, 1），本實(shí)驗(yàn)中取0.5；|0()－Y()|為母序列與子序列的絕對(duì)差值；minmin|0()－Y()|絕對(duì)差值的最小值，又記為Dmin；maxmax|0()－Y()|為絕對(duì)值的最大值，又記為Dmax。

2.8.3 關(guān)聯(lián)度（）的計(jì)算實(shí)質(zhì)上是對(duì)時(shí)間序列幾何關(guān)系的比較，是母序列與子序列各個(gè)時(shí)刻的的平均值，根據(jù)“2.8.1”項(xiàng)和“2.8.2”項(xiàng)計(jì)算，峰1～8的值依次為0.689 4、0.679 1、0.698 8、0.670 8、0.668 4、0.635 1、0.640 4、0.825 9。由不同批次翼核果相關(guān)峰與其抗氧化作用的關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)可知，對(duì)抗氧化作用藥效貢獻(xiàn)由大到小的特征峰依次為峰8＞峰3＞峰1＞峰2＞峰4＞峰5＞峰7＞峰6，并采用對(duì)照品對(duì)2、5、6、8號(hào)峰進(jìn)行指認(rèn)，依次為大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。

3 討論

翼核果HPLC指紋圖譜以及4種成分的含量測(cè)定過(guò)程中，通過(guò)HPLC-PDA在210～400 nm進(jìn)行全波段掃描，綜合考慮選取285 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)；分別比較無(wú)水乙醇、95%乙醇、60%乙醇、甲醇、60%甲醇等不同溶劑的提取效果及甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明甲醇為提取溶劑，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)色譜峰數(shù)目最多，分離效果最佳。

翼核果指紋圖譜中，樣品S14高達(dá)80個(gè)色譜峰，樣品S7只有25個(gè)色譜峰，有2批樣品含有60～70個(gè)色譜峰，有2批樣品含有50～60個(gè)色譜峰，有3批樣品含有40～50個(gè)色譜峰，另有6批樣品含有30～40個(gè)色譜峰，顯示不同產(chǎn)地樣品存在較大差異。翼核果分布于我國(guó)廣西、廣東、福建、臺(tái)灣等省，由于地區(qū)差異可能導(dǎo)致翼核果的品質(zhì)存在差異，進(jìn)而影響其藥效。由聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，15批藥材大致分為3類(lèi)，S1～S10、S14聚為一類(lèi)，S12、S13聚為一類(lèi)，S11、S15為另外一類(lèi)。聚類(lèi)分析結(jié)果與產(chǎn)地?zé)o明顯相關(guān)性，推測(cè)可能與加工、儲(chǔ)藏、采收期等因素有關(guān)，由于樣品數(shù)量小、信息量有限，具體原因還有待進(jìn)一步研究。PCA分析結(jié)果顯示，15批HPLC指紋圖譜共有峰中提取了3個(gè)主成分，除S13外，與聚類(lèi)分析結(jié)果較為一致，2種分析的方法相互印證。后續(xù)又測(cè)定大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種有效成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同批次間含量存在較大差異，為控制不同產(chǎn)地翼核果的質(zhì)量提供了有效方法。

翼核果在傳統(tǒng)上可應(yīng)用于治療慢性肝炎、肝硬化[3]；現(xiàn)代研究也表明，翼核果及其提取物具有多重功效，可以減輕乙醇所致小鼠急性肝損傷的影響，其醇提物能降低乙醇所致小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高，提高肝臟過(guò)氧化氫酶和總抗氧化能力，且可明顯減輕肝組織病理改變[10]；抗氧化能力是有效反映肝損傷與肝再生失衡狀態(tài)評(píng)價(jià)的重要因素。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法將抗氧化藥效的細(xì)胞模型與不同批次的翼核果藥材醇提物的特征峰峰面積進(jìn)行關(guān)聯(lián)，說(shuō)明翼核果抗氧化作用是“化學(xué)成分群”共同作用的結(jié)果，并采用對(duì)照品對(duì)大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4個(gè)成分進(jìn)行了指認(rèn)，但有一些成分尚未明確。究竟是哪些成分起作用，如何起作用還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)在建立翼核果HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)模式識(shí)別法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)；建立多成分含量測(cè)定，為翼核果的質(zhì)量控制提供依據(jù)；并研究其抗氧化活性，并通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析建立其譜效關(guān)系, 為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chromatographic fingerprints and antioxidant activity ofbased on chemical pattern recognition

HUANG Jian-you1, 2, HU Xiao-xi1, HUANG Zhou-feng1, 2, LU Guo-shou1, 2, TAN Xiao1, LAN Chang-zhen3

1. Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences, Nanning 530022, China 2. Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Stardands, Nanning 530022, China 3. Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Based on chemical pattern recognition, the HPLC fingerprints and multi-component content determination ofwas established to provide basis for further development and utilization.The HPLC fingerprints of 15 batches ofwere established to determine the common peaks. Four chemical components were identified and the content of the samples were determined by comparison with the reference materials. Cluster analysis principal component analysis were carried out by SPSS 19.0 and SIMCA 14.1 software. The antioxidant activity was determined by DPPH method，and spectrum-effect relationship was established by gray correlation analysis.Eight chromatographic peaks were selected as the common peaks of the fingerprint, 15 bathes ofcould be divided into three categories by cluster analysis, and the results of principal component analysis and cluster analysis were basically the same; By principal component analysis, the cumulative variance contribution rate of the three principal component factors was 80.505%. The content emodin-8--β--glucopyranoside, emodin, chrysophanol and physcion were 0.06—2.08 mg/g, 3.57—17.03 mg/g, 0.04-1.53 mg/g, 0.10—1.59 mg/g. 15 batches of samples all showed antionxidant activities. The correlation between HPLC fingerprint and the antioxidant activity was from 0.8259 to 0.6351.The contribution of chemical compositions represented by each characteristic peak to the antioxidant activity was in the order of peak 8＞peak 3＞peak 1＞peak 2＞peak 4＞peak 5＞peak 7＞peak 6.The antioxidant activity ofmay be the combined effect of a variety of chemical constituents. The establishment of HPLC fingerprint of. and the application of chemical pattern recognition can provide scientific basis for quality control of.

Benth.; fingerprint; emodin-8--β--glucopyranoside; emodin; chrysophanol; physcion; anti-oxidant activity; chemical pattern recognition; gray correlation analysis

R282.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 5021 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.027

2021-01-13

廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AD17195002）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016GXNSFAA380092）；廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題（桂中重自201506，桂中重自201601）

黃建猷（1981—），男，副主任藥師，主要從事中藥、民族藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail: dearhuangjianyou@126.com

陸國(guó)壽（1980—），男，副主任藥師，主要從事中藥、民族藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail: luguoshou@foxmail.com

#并列第一作者：胡筱希（1991—），女，助理研究員，主要從事天然藥物化學(xué)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: huxiaoxi0124@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]