李 蕊，趙金偉，寧停波，姚景春，梁紅寶*

基于網絡藥理學和分子對接方法研究山花晶顆?？挂暺诘淖饔脵C制

李 蕊1, 2，趙金偉1, 2，寧停波1, 2，姚景春1, 2，梁紅寶1, 2*

1. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006 2. 山東新時代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 276006

基于網絡藥理學探討山花晶顆?？挂暺诘淖饔脵C制。利用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）和中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN）篩選山花晶顆粒的活性成分和潛在作用靶點，通過STRING數據庫富集信號通路；采用Cytoscape軟件分析蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡中的關鍵靶點，采用分子對接實驗對主要活性成分和關鍵靶點的結合能力進行驗證。山花晶顆粒篩選出槲皮素、熊果酸、大黃素等66個主要活性成分以及多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）、5-羥色胺受體1A（5-hydroxytryptamine receptor 1A，HTR1A）、毒蕈堿型膽堿受體M2（cholinergic receptor muscarinic 2，CHRM2）等34個潛在作用靶點，富集分析出神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、環(huán)單磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路等35條相關信號通路，分子對接結果表明主要活性成分與關鍵作用靶點的對接構象合理。山花晶顆粒能夠通過“多成分-多靶點-多通路”抑制細胞凋亡和炎性因子的產生，從而減輕眼部細胞氧化和損傷，發(fā)揮抗視疲勞的作用。

山花晶顆粒；視疲勞；網絡藥理學；分子對接；山柰酚；芹菜素；槲皮素

隨著現代生活節(jié)奏的加快，以及手機、電腦的普及應用，人們用眼時間不斷延長，視疲勞已成為目前眼科常見的臨床疾病之一[1]。視疲勞又稱眼疲勞，主要以視物模糊、不耐久視、干澀不適、酸脹流淚等為臨床表現。中醫(yī)學將視疲勞稱為肝勞，病因為過用目力、情志內傷、外感濕邪、飲食偏嗜，其中以過用目力為最主要因素；病機以虛為主，虛實夾雜；常夾郁夾濕，病位以肝、腎、氣為主，證候大致可分為肝腎陰虛、肝腎陰虛夾氣滯、肝腎陰虛夾濕3型，其中以肝腎陰虛最為多見[2]。

菊花和枸杞子作為清肝明目的著名藥對，出現在石斛夜光丸、枸菊地黃丸等多個經典方中[3]。菊花具有清熱解毒、去肝火的功效[4]；枸杞具有滋補肝腎、養(yǎng)肝明目的功效[5]?，F代藥理學研究發(fā)現，菊花、枸杞子中含有豐富的多糖、黃酮類、葉黃素等多種活性成分，具有清除自由基、改善眼部不適的作用[6-11]。山花晶顆粒是在菊花和枸杞子的基礎上增加1味山楂而成，山楂具有調血脂、抗癌、抗氧化和增強免疫力的藥理作用[12]，且山楂與枸杞子配伍可以協同調血脂和抗氧化[13]。山花晶顆粒具有滋補肝腎、清肝明目的功效，臨床上主要用于治療肝腎陰虛引起的眼睛干澀、視力模糊、目赤腫痛等視疲勞癥狀，亦可用于高血壓、高血脂癥，但其抗視疲勞的藥效成分及關鍵作用靶點尚不清楚。本研究基于網絡藥理學對山花晶顆粒中的活性成分及作用機制進行預測，并通過分子對接方法驗證活性成分與靶點的結合能力，以期為山花晶顆粒的進一步開發(fā)及應用提供依據。

1 方法

1.1 山花晶顆?；钚猿煞质占鞍悬c篩選

借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[14-15]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”為關鍵詞，以口服生物利用度≥20%、類藥性≥0.1為篩選條件[16-17]，并結合文獻整理菊花、枸杞子和山楂的活性成分，根據篩選后的化學成分收集對應的藥物靶點；借助中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）[18]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”為關鍵詞，收集山花晶顆粒中的活性成分，以Target score≥20為篩選條件，保留符合條件的活性成分對應的藥物靶點[19]。

1.2 “中藥-活性成分-藥物靶點”網絡的構建

通過TCMSP和BATMAN在線數據庫篩選藥物作用靶點，借助UniProt（https://www.uniprot.org/）校正靶點對應的基因名，限定物種為人。采用Cytoscape 3.6軟件構建“中藥-活性成分-藥物靶點”網絡圖，用Network Analyzer插件分析山花晶顆粒的活性成分和藥物靶點。

1.3 抗視疲勞潛在作用靶點的獲取

由于收集到的疾病靶點與視疲勞的相關性較差，本研究選擇從藥物靶點出發(fā)，尋找潛在作用靶點。從TCMSP數據庫[20]中篩選出菊花、枸杞子、山楂所對應的靶點，整合后刪除重復項，得到TCMSP數據庫藥物總靶點；從BATMAN數據庫[21]中篩選出3味藥材對應的靶點，整合后刪除重復項，得到BATMAN數據庫藥物總靶點。為避免單個數據庫收載藥物靶點的偏向性，提高與抗視疲勞功效的相關性，將2個數據庫中篩選出的藥物總靶點同時在線導入Venn在線軟件作圖工具平臺進行Venn分析，獲得的交集靶點即為抗視疲勞潛在作用靶點。

1.4 抗視疲勞潛在作用靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

將抗視疲勞潛在作用靶點在線導入STRING數據庫（https://string-db.org/），限定物種為人，得到蛋白與蛋白間的相互作用信息[22-23]，將獲得的數據導入Cytoscape 3.6軟件，生成PPI網絡圖。通過CytoNCA插件對網絡進行拓撲分析，分析內容包括中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、接近中心性（closeness centrality，CC）。

1.5 關鍵靶點的富集分析

將關鍵靶點在線導入STRING網站，得到基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析[24-25]。以＜0.01為基本標準，按由小到大的順序選擇前20條基因注釋目錄和信號通路目錄進行分析，運用R軟件對分析結果進行可視化處理。

1.6 活性成分與靶點的分子對接驗證

選擇PPI網絡中度值排名靠前的5個靶點作為關鍵靶點，將整理的所有活性成分與關鍵靶點進行對接。從TCMSP數據庫下載活性成分的分子結構，導入Sybyl-X 2.0軟件，運用Minimize模塊進行能量優(yōu)化，獲得穩(wěn)定的分子構象，mol2格式輸出保存。通過蛋白質數據庫（https://www.rcsb.org/）[26]下載靶點的結晶復合物，格式選擇pdb，采用Sybyl-X 2.0軟件的標準對接模塊進行分子對接，刪除靶點內的水分子，添加非極性氫原子，抽取蛋白原配體，以便生成對接位點空腔進行對接。對接完成后，根據低能量和構象合理的原則選擇最佳對接構象。

1.7 中藥-歸經網絡的構建

通過檢索《中國藥典》2020年版[27]，獲得山花晶顆粒中山楂、菊花、枸杞子3味中藥的歸經，構建山花晶顆粒中藥-歸經網絡。

2 結果

2.1 山花晶顆粒活性成分收集及靶點篩選

通過數據庫檢索以及文獻查閱[28-31]，共得到66個活性成分見表1，其中山楂有15個、菊花36個、枸杞子24個，有7個重復活性成分，有2個活性成分存在于3味藥材中。

表1 山花晶顆粒中的活性成分

續(xù)表1

編號活性成分CAS號來源 MOL53異葒草素4261-42-1山楂 MOL54長葉蒎烯5989-08-2菊花 MOL55γ-廣藿香508-55-4菊花 MOL56羊毛甾醇79-63-0枸杞子 MOL57膽固醇57-88-5枸杞子 MOL58落花生油酸2416-19-5枸杞子 MOL59野芝麻新苷27934-98-1枸杞子 MOL60巖皂甾醇17605-67-3枸杞子 MOL61二氫膽固醇29466-38-4枸杞子 MOL62鈍葉醇16910-32-0枸杞子 MOL63亞油酸乙酯544-35-4枸杞子 MOL64禾本甾醇1176-52-9枸杞子 MOL6524-乙基膽甾-4-烯-3-酮67392-96-5山楂 MOL66維生素B283-88-5菊花

2.2 “中藥-活性成分-藥物靶點”網絡的構建

“中藥-活性成分-藥物靶點”網絡見圖1，包含303個節(jié)點和1062條邊。通過Network Analyzer插件分析網絡的拓撲學性質，BC、CC和DC均較大的活性成分為槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇，分別對應147、63、60、50、43個靶點，為網絡的中心節(jié)點，表明這些活性成分與靶點的相互作用在網絡中起到了關鍵作用，不同活性成分作用于多個不同靶點，同一靶點也對應不同活性成分，體現出山花晶顆粒是多成分、多靶點的網絡體系。

“SHJ”表示山花晶顆粒；橘色橢圓形表示枸杞子，綠色橢圓形表示山楂，藍色橢圓形表示菊花；紅色菱形表示共有成分，橘色菱形表示枸杞子活性成分，綠色菱形表示山楂活性成分，藍色菱形表示菊花活性成分；粉色長方形表示靶點

2.3 作用靶點的Venn分析

將TCMSP和BATMAN數據庫中共有的藥物靶點作為潛在作用靶點，即233個藥物靶點和528個藥物靶點同時在線導入Venn在線軟件作圖工具平臺進行Venn分析，獲得交集靶點68個見圖2，即可能為山花晶顆?？挂暺诘臐撛谧饔冒悬c。

圖2 TCMSP與BATMAN數據庫藥物靶點交集分析

2.4 PPI網絡的構建

將68個交集靶點在線導入STRING數據庫，得到蛋白間的相互作用信息和KEGG信號通路，在逐個篩查前30條中，找到4條與肝臟、眼睛相關的信號通路。將此4條通路上的靶點進行富集，得到34個靶點，導入STRING數據庫得到蛋白間相互作用信息，運用Cytoscape 3.6軟件，通過插件cytoNCA對網絡進行拓撲分析，計算得到DC、BC、EC、CC的中位數分別為7、21.994 42、0.117 226 253、0.488 915 71。根據大于中位數的篩選標準，選出13個關鍵節(jié)點，對PPI進行網絡清晰化，見圖3。越靠近中心區(qū)域的靶點相互作用越強，最內圈的多巴胺D2受體（dopamine receptor D2，DRD2）、5-羥色胺受體1A（5-hydroxytryptamine receptor 1A，HTR1A）、膽堿能毒蕈堿受體2（muscarinic acetylcholine receptors，CHRM2）、一氧化氮合成酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）、毒蕈堿型膽堿受體M1（cholinergic receptor muscarinic 1，CHRM1）、μ-阿片受體（μ-opioid receptor，OPRM1）、腎上腺素能受體α2a（adrenergic receptor α2a，ADRA2A）、谷氨酸受體2（glutamate receptor 2，GRIA2）、ADRA2C、ADRA2B、γ-氨基丁酸A受體α1（gamma aminobutyric acid A receptor α1，GABRA1）、腎上腺素能受體β2（adrenergic receptor β2，ADRB2）、GABRA2為山花晶顆粒抗視疲勞的潛在作用靶點。

圖3 34個富集靶點的PPI網絡

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將34個靶點在線導入STRING網站，得到GO和KEGG富集分析數據。GO功能注釋包括細胞組分、分子功能和生物過程3個方面，分別得到42、58、437個目錄，細胞組分主要涉及質膜組成、突觸后膜和γ-氨基丁酸-α受體復合物；分子功能主要與G蛋白偶聯胺受體活性、神經遞質受體活性、跨膜信號受體活性、信號受體活性、腎上腺素能受體活性等相關；山花晶顆粒的生物過程主要涉及腺苷酸環(huán)化酶調節(jié)G蛋白偶聯受體信號通路、管徑調節(jié)、血管直徑的調節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號通路、信號轉導、G蛋白偶聯受體信號通路、血液循環(huán)、系統過程調節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶激活G蛋白偶聯受體信號通路、平滑肌收縮的調節(jié)。KEGG富集分析有60個目錄，以＜0.01為標準進行富集分析，主要涉及到神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、環(huán)單磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）-cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）信號通路、膽堿能突觸、糖尿病并發(fā)癥中的年齡-晚期糖基化終產物受體（receptor of advanced glycosylation end-products，RAGE）信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號、逆行內源性大麻素信號、γ-氨基丁酸能突觸、多巴胺能突觸、缺氧誘導因子-1信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)等信號通路。GO和KEGG前20條目錄見圖4、5。

圖4 山花晶顆粒GO功能富集分析

圖5 山花晶顆粒KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證

以靶蛋白結構內的原配體作為對照，將篩選出的所有活性成分與5個關鍵靶點（DRD2、HTR1A、CHRM2、NOS3、CHRM1）對應的活性位點（6CM4、5V54、5YC8、1M9J、5CXV）進行分子對接，結果見表2。小分子與受體結合時的能量越低、構象形狀匹配度越高，則對接打分值越高，表明小分子具有的潛在作用活性越強。3個小分子對比原配體，對接打分值十分接近，表明篩選出的活性成分具有與原配體相當的作用活性。

表2 山花晶顆粒主要活性成分與關鍵靶點的分子對接

選取度值排名靠前的活性成分槲皮素、芹菜素和山柰酚進行結果展示見圖6，槲皮素、芹菜素和山柰酚在DRD2、HTR1A、CHRM2、NOS3和CHRM1靶點蛋白活性位點內的對接構象穩(wěn)定、匹配度良好，均可與靶蛋白形成氫鍵作用，結合活性良好。

粉色棍狀結構代表槲皮素，綠色棍狀結構代表芹菜素，黃色棍狀結構代表山柰酚，白色彩帶表示靶點蛋白結構，黃色虛線表示氫鍵相互作用

2.7 中藥-歸經網絡的分析

如圖7所示，中藥-歸經網絡中肝經的連接數為3，其余腎經、肺經、胃經、脾經的連接數均為1，可見山花晶顆粒的主要作用部位在肝。

圖7 中藥-歸經網絡

3 討論

早在2000年前，《黃帝內經》就論述了肝與目的關系，其后又得到了歷代醫(yī)家的補充和臨床驗證。《黃帝內經》曰：“肝氣通于目，肝和則目能辨五色矣”；明·繆希雍《本草經疏·卷二》云：“肝虛十證……目光短屬肝血虛腎水真陰不足”；清·林之翰《四診抉微》亦有云：“眼赤多淚積熱，頭眩不能俯視肝火……羞明怕日，肝腎并見”；由此可見中醫(yī)講眼病從肝治的道理所在。通過中藥-歸經網絡的分析結果可知，山花晶顆粒中3味藥材均入肝經，枸杞、菊花滋補肝腎、清熱解毒，山楂健脾消食、酸甘化陰，3藥合用，則可發(fā)揮養(yǎng)肝、瀉火、明目之功效。與臨床上治療肝腎陰虛引起的眼睛干澀、視力模糊、目赤腫痛等視疲勞癥的功效基本吻合。

本研究運用網絡藥理學的方法對山花晶顆粒所含成分及靶點進行分析，發(fā)現3味藥材共含66個活性成分，作用于233個藥物靶點；其中篩選出34個關鍵靶點，具有多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點。GO功能及KEGG通路富集分析可知，山花晶顆粒可能通過激活鈣信號通路和cAMP信號通路等激活下游磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路，調控凋亡通路，抑制各種凋亡蛋白，減少細胞凋亡，并抑制炎性因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等的產生，減輕眼部細胞的氧化和損傷，保護視網膜色素上皮細胞，與目前研究所證實的車前子、青葙子、熟地等歸肝經中藥發(fā)揮明目功效的作用機制基本相符[32-36]。分子對接結果表明，來自于山楂、菊花和枸杞子中度值較高的山柰酚、芹菜素和槲皮素3種黃酮成分與關鍵作用靶點蛋白匹配良好，提示該類化合物可能為核心活性成分群。

本研究應用網絡藥理學和分子對接的方法，對山花晶顆粒的多成分-多靶點與抗視疲勞靶點之間復雜網絡關系進行探究及驗證，初步闡釋了基于炎性細胞因子信號通路發(fā)揮抗視疲勞功效的作用機制，充分體現了中藥多組分、多靶點、多層次的整體調節(jié)作用，為進一步深入探討其作用機制奠定了基礎，為探索抗視疲勞的藥效物質基礎和作用機制提供了方向，同時為山花晶顆粒的進一步開發(fā)及應用提供了理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Shanhuajing Granules on reliving visual fatigue based on network pharmacology and molecular docking method

LI Rui1, 2, ZHAO Jin-wei1, 2, NING Ting-bo1, 2, YAO Jing-chun1, 2, LIANG Hong-bao1, 2

1. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 2. Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd., Linyi 276006, China

To investigate the mechanism of Shanhuajing Granules (山花晶顆粒) on reliving visual fatigue based on network pharmacology.TCMSP and BATMAN databases were used to obtain the active components and potential action targets, STRING database was utilized to gain interaction network information. The key targets of protein-protein interaction (PPI) network were analyzed by Cytoscape software, molecular docking was used to identify the binding ability between main active components and key targets.A total of 66 main active components such as quercetin, ursolic acid and emodin, 34 potential targets such as dopamine receptor D2 (DRD2), 5-hydroxytryptamine receptor 1 (AHTR1A), cholinergic receptor muscarinic 2 (CHRM2) and 35 related signaling pathways such as neuroactive ligand-receptor interaction, calcium signaling pathway, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway were obtained. Molecular docking results showed that the main active components docked into key targets.Shanhuajing Granules may inhibits cells apoptosis and production of inflammatory factors, reduce the oxidation and injury of eye cells by “multi-ingredient-multi-target-multi-pathway” mode, thereby relive visual fatigue.

Shanhuajing Granules; visual fatigue; network pharmacology; molecular docking; kaempferol; apigenin; quercetin

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4921 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.017

2021-02-01

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2018ZX09201010）

李 蕊（1992—），女，碩士，從事天然產物的提取研究。Tel: 18560512583 E-mail: yuxuanliunian928@163.com

梁紅寶，碩士，高級工程師，從事中藥的研究與開發(fā)。E-mail: lianghongbao1985@163.com

[責任編輯 李亞楠]