譚小娟，李世雄，李瓔峪，趙 靖，李原華，劉瑞連，劉文龍*，張喜利*

白術飲片的指紋圖譜形狀特征與質量標志物（Q-Marker）研究

譚小娟1, 2, 4，李世雄1, 4#，李瓔峪1, 4，趙 靖1, 4，李原華1, 4，劉瑞連3，劉文龍1, 4*，張喜利1, 4*

1. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208 2. 瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300 3. 湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410208 4. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

根據(jù)白術指紋圖譜形狀特征，建立一種快速精準辨識不同產地與炮制品的方法。建立45批不同產地與炮制法的白術UPLC指紋圖譜庫，運用總量統(tǒng)計矩及相似度法、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares- discriminant analysis，OPLS-DA）法辨析此指紋圖譜的形狀特點，捕獲其特征指紋圖譜及特征峰。生品、麩炒、土炒白術UPLC指紋圖譜的共有峰16個；安徽與湖南、安徽與浙江、湖南與浙江產地的生白術的總量統(tǒng)計矩相似度分別為0.774～0.982、0.799～0.969、0.788～0.886；3產地的生品與麩炒、生品與土炒、麩炒與土炒白術的總量統(tǒng)計矩相似度中最大值為0.990，最小值為0.774。再結合OPLS-DA法中變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）分析獲得其中1～3、6、16號為區(qū)分貢獻度最大的5個標志峰，確認6號峰為白術內酯II。這5個標志峰對應物質可認定白術的潛在質量標志物（Q-Marker），為白術的產地、炮制法的精準識別及其質量控制與評價提供理論與實驗依據(jù)，同時也為中藥指紋圖譜辨形論質做了積極探索。

白術；指紋圖譜；辨形論質；總量統(tǒng)計矩相似度法；OPLS-DA；質量標志物；炮制；質量控制

中藥指紋圖譜具有整體性的特點，突出中藥的完整面貌，在中藥及其復方的質量研究中已逐漸展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[1-10]。中藥整張指紋圖譜的形狀特征能夠全面反映所含成分的種類與含量，欲從宏觀上評價控制中藥質量，需對其形狀特征進行定性定量分析。常見的指紋圖譜分析法有夾角余弦法、相關系數(shù)法、主成分分析法等。總量統(tǒng)計矩相似度法是本實驗團隊早期建立的定性定量辨識中藥指紋圖譜形狀特征的新方法[11]。該方法在指紋圖譜的數(shù)學分析方面有其獨特優(yōu)勢，不僅具有抗干擾性，能夠降低各峰分離狀態(tài)、形狀等測試方法的要求，并且具有加合運算的特征，能消除溶劑干擾，獲得純品的總量統(tǒng)計矩參數(shù)；能與多維向量偶聯(lián)構成多維曲線中心矩及偏差分析。其中總量零階矩為定量分析參數(shù)，總量一階矩與總量二階矩為定性分析參數(shù)[12-15]。

白術為菊科蒼術屬植物白術Koidz.的干燥根莖。味苦、甘，溫。歸脾、胃經。有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎功效[16]。白術在《神農本草經》中被列為上品，主產于南方各地，其中浙江地區(qū)產量最大，質量最 好[17]。麩炒法和土炒法為白術現(xiàn)代炮制的常用方法，且《中國藥典》2020年版收載了白術和麩炒白術2種飲片規(guī)格。研究表明，麩炒白術能夠“減酮減燥，增酯增效”，減少對胃腸的刺激性，緩和藥 性[18-19]；土炒白術有提高機體抗炎和抗癌效果，增強抗氧化、免疫能力等功效[20]。

中藥質量標志物（quality markers，Q-Marker）能夠以整體、系統(tǒng)、量化的標準對中藥質量進行綜合性評價，其與中藥的本身屬性，炮制工藝、藥理作用、生物代謝等息息相關[21]。近年來有關白術的藥理作用、化學成分等研究較為全面，而指紋圖譜研究更多針對于單一產地或單一炮制品，未曾系統(tǒng)建立白術的UPLC指紋圖譜庫，缺乏系統(tǒng)內部比較與大數(shù)據(jù)更難以尋找Q-Marker，且缺乏一種快速精準判斷的方法。本研究將基于總量統(tǒng)計矩相似度法及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）法分析指紋圖譜，通過辨析白術飲片指紋圖譜形狀特點，評論生白術、麩炒白術、土炒白術3種炮制品，安徽、湖南、浙江3個產地白術飲片之間的質量異同，獲得白術飲片的特征指紋圖譜，鎖定其質量標志物，為白術的產地、炮制的精準識別及其質量控制與評價提供新思路與方法。最終為中藥質量控制與評價提供新視野與實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class系統(tǒng)，四元溶劑泵、自動進樣裝置、在線真空脫氣裝置、PDA檢測器、Empower3色譜工作站、柱溫箱，美國沃特世公司；MS205DU電子分析天平，Mettler Toledo集團；JCS-31002C電子天平，哈爾濱眾匯衡器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，杭州藍天化驗儀器廠；SB-5200 DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 藥材與試劑

白術原藥材來源于安徽、湖南、浙江當?shù)厮幉氖袌?，經湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室石繼連教授鑒定為菊科植物白術Koidz.的干燥根莖，批號及產地見表1。

對照品白術內酯I（批號DST181006-014，質量分數(shù)≥99%）、白術內酯II（批號DST180122-015，質量分數(shù)≥99%），成都德斯特生物技術有限公司；磷酸，重慶川東化工有限公司，分析純，批號20140801；乙腈（批號19035217）、甲醇（批號20035265），色譜純，美國天地公司；麥麩，中糧面業(yè)（濮陽）有限公司；灶心土為湖南當?shù)夭少?；水為怡寶純凈水?.22 μm微孔濾膜。

表1 白術原藥材產地批次信息

2 方法與結果

2.1 麩炒白術、土炒白術的制備

2.1.1 麩炒白術 取安徽、湖南、浙江共15批白術飲片，按《全國中藥炮制經驗與規(guī)范集成（增修版）》麩炒白術（湖南2010）[22]進行麩炒白術的炮制。取凈白術片，按白術-麥麩10∶1比例，將麥麩撒入熱鐵鍋內，待冒煙時，投入白術片，不斷翻炒，炒至白術呈黃棕色，偶見焦斑。略有焦香氣。篩去麥麩即可。安徽產地對應編號為AH6～AH10，湖南產地對應編號為HN6～HN10，浙江產地對應編號為ZJ6～ZJ10。

2.1.2 土炒白術 取安徽、湖南、浙江共10批白術飲片，按《全國中藥炮制經驗與規(guī)范集成（增修版）》土白術（湖南2010）[22]進行土炒白術的炮制。取凈白術片，按白術-灶心土4∶1比例，將土粉置鐵鍋內，用中火加熱，炒至土呈靈活狀態(tài)時，投入白術片，炒至白術表面均勻掛土粉時，篩去土粉即可。安徽產地對應編號為AH11～AH15，湖南產地對應編號為HN11～HN15，浙江產地對應編號為ZJ11～ZJ15。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯I對照品1.13 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成226 μg/mL的溶液，即得；精密稱取白術內酯II對照品2.40 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇制成96 μg/mL的溶液，即得。取白術內酯I、II對照品溶液各500 μL，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取白術飲片粉末（過四號篩）約2 g，稱定后置50 mL錐形瓶中，加入甲醇35 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～4 min，5%～48%乙腈；4～15 min，48%～49%乙腈；15～28 min，49%～95%乙腈；28～30 min，95%～5%乙腈；柱溫28 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量2 μL；全波長掃描200～400 nm，通過比對，選取240 nm。

2.4 精密度試驗

取ZJ2白術藥材粉末，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄指紋圖譜，以白術內酯I為參比峰，計算圖譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.88%，相對峰面積RSD為0.20%～3.08%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.5 重復性試驗

取ZJ2白術藥材粉末6份，按“2.2.2”項方法平行制備供試品溶液6份，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以白術內酯I色譜峰為參比峰，計算各主要色譜峰相對峰面積和相對保留時間。結果各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.66%，相對峰面積RSD為1.42%～4.73%，表明實驗重復性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取ZJ2白術藥材粉末，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄色譜圖，以白術內酯I色譜峰為參照峰，計算各主要色譜峰相對峰面積和相對保留時間。結果在0～24 h內，各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.28%，相對峰面積RSD為0.89%～4.91%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.7 白術、麩炒白術、土炒白術HPLC指紋圖譜的建立

將45批白術及炮制品藥材樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.3”項下的色譜條件進樣，記錄各樣品溶液的色譜圖。將45批白術及其炮制品指紋圖譜數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統(tǒng)（2012版）”，以中位數(shù)法，時間窗寬度為0.5 min，經多點校正后，分別生成生白術、麩炒白術、土炒白術的對照指紋圖譜。

通過比對篩選確定生白術、麩炒白術土炒白術共有16個共有標志峰。經過色譜比對，指認出其中6號峰為白術內酯II，10號峰為白術內酯I，且峰6、10分離度均大于1.5。45批白術及炮制品指紋圖譜疊加見圖1，生白術、麩炒白術、土炒白術對照指紋圖譜及白術內酯I、白術內酯II混合對照品溶液圖譜見圖2。

2.8 不同產地白術原藥材分析

2.8.1 指紋圖譜總量統(tǒng)計矩相似度法分析 總量統(tǒng)計矩相似度法計算3產地15批白術UPLC指紋圖譜相似度，其相似度結果見表2。安徽白術與湖南白術相似度為0.774～0.982，安徽白術與浙江白術相似度為0.799～0.969，湖南白術與浙江白術相似度為0.788～0.886，結果表明，3產地之間的相似度明顯較低，尤其是湖南與浙江的白術相似度沒有高于0.89的樣品。表明白術不同產地之間成分群含量差異明顯。

圖1 45批白術飲片UPLC指紋圖譜

6-白術內酯II 10-白術內酯I

2.8.2 OPLS-DA 將15批3產地白術指紋圖譜16個特征峰峰面積數(shù)據(jù)導入SMICA 13.0中進行OPLS-DA，根據(jù)白術UPLC指紋圖譜16個特征峰峰面積得到得分圖結果見圖3。依據(jù)得分圖，生白術飲片按照產地不同，依據(jù)本方法可以明顯的區(qū)分為3類，即安徽、湖南、浙江。其中該模型的主成分回歸系數(shù)2Y＝0.894＞0.5，說明模型的預測能力較強，表明樣本間具有明顯分離的趨勢；2Y＝0.971，說明自變量（共有峰）的變化能夠解釋導致97.1%不同分類（因變量）的發(fā)生，表明模型的擬合度較好。其分離程度明顯也與相似度差異較大相佐證。16個特征峰在區(qū)別白術不同產地的貢獻程度，按照變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值＞1為原則，得出1～3、5、6、10、12、15、16峰對區(qū)分樣品作用較大，是區(qū)分不同產地間樣品的關鍵峰。

表2 3產地15批白術指紋圖譜總量統(tǒng)計矩相似度

圖3 3產地白術OPLS-DA得分圖和VIP圖

2.9 不同白術炮制品分析

2.9.1 總量統(tǒng)計矩相似度法分析 總量統(tǒng)計矩方法計算45批白術及其炮制品的UPLC指紋圖譜相似度，其總量統(tǒng)計矩參數(shù)結果見表3?？偭苛汶A矩（AUCT），總量一階矩（T）、總量二階矩（T2）依據(jù)總量統(tǒng)計矩相似度法[11-15]計算，15批白術指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩相似度為0.800～0.998，15批麩炒白術相似度為0.847～0.995，15批土炒白術相似度為0.907～0.998。15批白術與麩炒白術的相似度為0.746～0.990，白術與土炒白術相似度為0.789～0.990，麩炒白術與土炒白術相似度為0.760～0.989，不同炮制品之間相似度下降，白術與各炮制品之間存在差異性。

2.9.2 不同炮制品指紋圖譜分析 以白術、麩炒白術、土炒白術的對照指紋圖譜為依據(jù)進行分析可知，麩炒白術、土炒白術與白術指紋圖譜差異不大，但其中化學成分的含量發(fā)生明顯的變化，其含量變化也是區(qū)分不同炮制品的關鍵方向。結果見圖4。白術麩炒后，峰1、7有所增加，峰16含量有了明顯的增加；峰3、6含量有明顯的減少。白術土炒后、峰8、9含量有所增加，峰7、16有明顯增加，其余峰含量與白術相近。通過圖4可明顯看出，峰7、15、16的相對峰面積，均為白術炮制后（麩炒、土炒）＞炮制前（生品），且變化較為明顯，峰5、6、12的相對峰面積均為白術炮制前（生品）＞炮制后（麩炒、土炒），其中峰12減少較為明顯，其余峰炮制前后峰面積相近。白術內酯I炮制前后含量并沒有明顯改變，表明其作為評價研究不同炮制品的屬性差異作用較小。白術內酯II在土炒后含量變化較小，但麩炒之后白術內酯II的含量有明顯的減少。

2.9.3 OPLS-DA 將白術炮制品指紋圖譜16個特征峰峰面積數(shù)據(jù)導入SMICA 13.0中，按照3個產地分別進行OPLS-DA，根據(jù)白術炮制品UPLC指紋圖譜16個特征峰峰面積得到OPLS-DA得分圖結果見圖5。根據(jù)OPLS-DA得分圖，3個產地中的白術炮制品均可以明顯的區(qū)分為3類，即白術、麩炒白術、土炒白術，表明白術炮制前后具有明顯的差異性，該結果具有規(guī)律性，且與相似度分析佐證。16個特征峰在區(qū)別白術炮制前后的貢獻程度，按照VIP＞1為原則，綜合3個產地的結果得出1～3、6、16峰對區(qū)分樣品作用大，是區(qū)分樣品的關鍵色譜峰，其中峰6即為白術內酯II。

表3 45批白術、麩炒白術、土炒白術總量統(tǒng)計矩參數(shù)

圖4 白術炮制前后共有峰峰面積及白術內酯I、白術內酯II含量變化

結合“2.8.2”項中區(qū)分不同產地的關鍵峰，得出1～3、6、16峰既是區(qū)分不同炮制品，又是區(qū)分不同產地的關鍵峰。

圖5 3產地白術3種炮制品指紋圖譜OPLS-DA圖和VIP圖

3 討論

在白術飲片指紋圖譜探索中，流動相共研究了水-甲醇、水-乙腈、0.05%磷酸水溶液-乙腈，發(fā)現(xiàn)0.05%磷酸水溶液-乙腈按照洗脫程序洗脫時，色譜峰分離度較好，出峰穩(wěn)定，峰形較好，故流動相選用0.05%磷酸水溶液-乙腈；柱溫考察了28、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)柱溫為28 ℃時，色譜峰分離度較好，出峰時間適中，故柱溫選擇了28 ℃。體積流量考察了0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min，發(fā)現(xiàn)體積流量為0.3 mL/min時，出峰時間適中，色譜峰分離度較好，且考慮到時間成本等關系，故體積流量選擇了0.3 mL/min。

本研究采用UPLC技術，建立了白術、麩炒白術、土炒白術的指紋圖譜，研究辨析不同產地、不同炮制品的中藥指紋圖譜的形狀特點，標定出16個指紋圖譜特征峰，指認出白術內酯I、白術內酯II2個色譜峰，并基于本團隊總量統(tǒng)計矩相似度計算相似度，結合OPLS-DA法發(fā)現(xiàn)不同炮制方法、不同產地的白術飲片及其炮制品均具有明顯差異性，且不同產地的白術飲片相似度更低，分離趨勢更為明顯。表明相比較于炮制方法因素，產地因素對于白術飲片質量的影響更明顯。盲法選取不同產地或炮制方法的白術樣品，按照本研究所建立的方法進行實驗驗證，即依次采用液相指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩相似度法、OPLS-DA法統(tǒng)計分析，白術樣品分別落在了OPLS-DA圖所對應的不同產地或不同炮制方法區(qū)域內，表明可以快速精準地識別所不同產地和炮制法的白術。值得一提的是，需要進一步藥效學實驗研究才能探究本實驗確定的5個質量標志物與白術的功效，如提高機體抗炎和抗癌效果等的內在關聯(lián)性。

本研究所建立的方法能夠明顯的按照不同產地、不同炮制方法將白術樣品進行分類，在現(xiàn)有缺乏快速精準識別藥材產地、炮制品方法的情況下，該法為進行產地、炮制的精準識別及其質量控制與評價提供一個新的理論與實驗的思路。本研究尋找到白術內這5種成分可作為后續(xù)的質量屬性研究、質量評價與控制的關鍵性物質Q-Marker。本研究應用了肖小河教授團隊的大質量觀理念[23]，結果表明整體辨析中藥指紋圖譜的形狀特點，能精準辨析白術的不同產地與炮制品，助力了中藥質量研究新進程。后續(xù)可利用UPLC-MS、藥效學、藥物代謝動力學等進一步探究本方法所篩選出的5個白術質量標志物的化學成分、藥理作用、性味歸經等相關內容，并可以此中藥為基礎，針對不同產地、炮制方法建立一整套質量控制評價體系模板。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on fingerprint shape characteristics and quality markers of

TAN Xiao-juan1, 2, 4, LI Shi-xiong1, 4, LI Ying-yu1, 4, ZHAO Jing1, 4, LI Yuan-hua1, 4, LIU Rui-lian3, LIU Wen-long1, 4, ZHANG Xi-li1, 4

1. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Liuyang Hospital of Chinese Medicine, Liuyang 410300, China 3. Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 4. Hunan Key Laboratory of Drug Gability and Preparation Modification of TCM, Changsha 410208, China

To establish a rapid and accurate identification method for different processed products and producing areas based on the fingerprint shape characteristics of Baizhu [(AMR)].A UPLC fingerprint database of 45 batches of AMR from different producing areas and processing methods was established. The shape characteristics of the fingerprint were analyzed by presidential statistical moment similarity method and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) method, and the characteristic fingerprint and characteristic peaks were captured.There were 16 common peaks in UPLC fingerprints of AMR, bran-processed AMR, soil-processed AMR; The presidential moment similarity between Anhui and Hunan, Anhui and Zhejiang, Hunan and Zhejiang were 0.774—0.982, 0.799—0.969 and 0.788—0.886, respectively. The maximum and minimum of the presidential moment similarity of crude products and bran-processed, crude products and soil-processed, bran-processed and soil-processed AMR from the three areas were 0.990 and 0.774, respectively. Combined with VIP analysis (variable importance for the projection) by OPLS-DA method, 1—3, 6, 16 peaks were the five marker peaks with the largest contribution to discrimination. Peak 6 was identified as atractylenolide II.The corresponding substances of these five marker peaks can be identified as the potential quality markers of AMR, which provides theoretical and experimental basis for accurate identification areas, processing method, quality control and evaluation of AMR, and mades active exploration on the quality of TCM fingerprint.

; fingerprint; quality by distinguishing shape; presidential moment similarity; OPLS-DA; quality markers; processing drugs; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 4844 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.009

2021-04-08

國家自然科學基金資助項目（81874344）；湖南省自然科學基金資助項目（2019JJ40220）；湖南省自然科學基金資助項目（2021JJ30514）；湖南省中管局項目（2021204）；湖南省中管局項目（2021073）；湖南省教育廳項目（19A366）；湖南省教育廳項目（19A382）；湖南省教育廳項目（19C1435）；長沙市科技計劃項目（kq1907136）；湖南省一流學科開放基金項目（2018YX11）

譚小娟，女，碩士研究生，從事中藥質量研究。Tel: 18711012368 E-mail: 18711012368@163.com

劉文龍，教授，博導，從事中藥質量與藥劑學等研究工作。Tel: 13974821547 E-mail: dragon5240@126.com

張喜利，女，副教授，從事中藥成藥性研究。Tel: 18229764227 E-mail: xiaoli610@126.com

#并列第一作者：李世雄，男，碩士研究生，從事中藥質量研究。Tel: 15339772189 E-mail: 576555387@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]