岳宗進 于露 劉汝銀 馮仲鍇 王新立 王西彬 魯花

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院脊柱科，河南 鄭州 450002)

腰痛是一種常見的肌肉骨骼疾病，嚴重影響了人類的生活質量，給社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔〔1〕。椎間盤退變(IDD)被認為是引起腰部疼痛的主要原因，是脊柱退變性疾病的病理基礎，以中老年發(fā)病居多，具有較高的發(fā)病率及致殘率。髓核(NP)細胞是構成椎間盤的主要細胞，在正常情況下可通過分泌Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)，聚集蛋白聚糖及基質金屬蛋白酶(MMPs)等參與細胞外基質(ECM)的合成及分解動態(tài)平衡進程。多項研究表明，IDD與炎癥、NP細胞凋亡及ECM降解息息相關〔2～4〕。西紅花酸是從中藥番紅花屬植物西紅花中提取出來的主要有效成分，屬類胡蘿卜素類物質，具有多不飽和共軛烯酸結構。研究證實西紅花酸有抗氧化應激、抗細胞損傷、降血糖及抗炎等功效〔5，6〕。此外，西紅花酸處理可加強脊髓損傷大鼠海馬神經(jīng)元軸突的生長，從而促進大鼠脊髓損傷功能恢復〔7〕。同時，西紅花酸還可通過抑制氧化應激及神經(jīng)炎癥減緩神經(jīng)病理性疼痛進程〔6〕。但是，西紅花酸在IDD中的作用尚不明確。因此，本研究探討西紅花酸對NP細胞損傷、炎癥應答及ECM代謝的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人NP細胞系(HNPC)購自上海鈺博生物科技有限公司(YB-ATCC-3536)；噻唑藍(MTT)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(G020-1-1)；一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司(K1622)；RIPA裂解液(P0013B)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)購自上海碧云天；ECL底物液購自Thermo公司(NCI5079)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司(IPVH00010)；白細胞介素(IL)-6(ab178013)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(ab181421)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、抗人MMP-3、MMP-13、p-p65核因子(NF)-κB、p-IκB及β-actin抗體購自Abcam公司。

1.2細胞的培養(yǎng)和處理 將HPNC置于含10%胎牛血清(FBS)及100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，所有細胞在37℃、5%CO2條件下進行孵育。

1.3細胞的處理及實驗分組 采用IL-1β處理體外模擬NP細胞退變微環(huán)境，將細胞分為以下幾組：①對照組：正常培養(yǎng)HPNC；②IL-1β組：用10 ng/ml的IL-1β處理HPNC 24 h；③西紅花酸組：設置5、10、50、100及200 μmol/L濃度處理12 h；④IL-1β+西紅花酸組；用50 μmol/L的西紅花酸及IL-1β處理細胞。

1.4MTT檢測細胞活性 在96孔培養(yǎng)板中按100 μl/孔加入細胞懸液，將其放置待細胞融合度達80%左右時，加入不同濃度的西紅花酸、10 ng/ml的IL-1β作用24 h；每孔加入50 μl 1×MTT試劑，37℃下孵育4 h，使MTT還原為甲臜；棄去上清后加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床下作用15 min；酶標儀檢測570 nm的吸光光度值，評估細胞活性。

1.5流式檢測細胞凋亡 收集不同處理組細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清；用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，離心后加195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞；加入5 μl的 Annexin V-FITC溶液，輕輕混勻后再加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液；室溫(20～25℃)下避光孵育15 min，將樣品置于FACSCalibur流式細胞儀上，評估不同處理對細胞凋亡的影響。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測mRNA水平 用Trizol裂解液抽提細胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書將抽提到的RNA逆轉錄合成cDNA；以合成的cDNA為模板，加入0.4 μl的ROX Reference Dye Ⅱ、特異性上下游擴增引物(0.8 μl)及10 μl的SYBR?Premix EX TaqTM Ⅱ構建qPCR體系，按照如下程序進行PCR：95℃ 30 s，循環(huán)1次；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次。其中以β-actin為內參，采用2-△△CT評估目的基因mRNA水平，特異性擴增引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

1.7ELISA檢測IL-6、TNF-α水平 收集對照組、IL-1β處理組、IL-1β和西紅花酸處理組細胞，按照IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α的濃度。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 采用RIPA裂解抽提不同處理組細胞總蛋白，按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書對抽提的蛋白進行定量分析；將等量目的蛋白樣品用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離電泳，隨后將目的蛋白電轉移至PVDF膜上；加入5%脫脂奶封閉膜上的非特異性反應，隨后加入抗人MMP-3、MMP-13、p-IκB、p-p65 NF-κB的一抗，4℃下過夜孵育；用TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1.5 h；加入ECL溶液進行顯色成像，以β-actin為內參，用Image J軟件對蛋白密度進行量化分析，結果以目標蛋白與β-actin比值表示。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結 果

2.1西紅花酸對HNPC存活的影響 MTT分析顯示，與對照組HNPC活性〔(99.67±3.96)%〕相比，西紅花酸濃度在5，10，50 μmol/L時可劑量依賴性地增加HNPC活性〔(118.43±2.95)%、(133.53±7.13)%、(141.17±6.88)%〕，且在50 μmol/L西紅花酸組活性最強(P<0.05)；西紅花酸濃度在100、200 μmol/L時HNPC活性〔(112.30±2.80)%、(79.93±5.20)%〕逐漸降低，且在200 μmol/L濃度時顯著性抑制細胞活性，提示其在此濃度時具有細胞毒性(P<0.05)。

2.2西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC存活及凋亡的影響 MTT分析顯示，與對照組HNPC存活率〔(98.47±4.16)%〕相比，IL-1β處理后可顯著性抑制HNPC的存活率〔(54.37±2.55)%，P<0.05〕，而西紅花酸(5、10、50、100 μmol/L)可劑量依賴性增加IL-1β組存活率〔(64.67±5.24)%、(69.33±4.85)%、(83.33±5.42)%、(73.20±2.96)%〕，且50 μmol/L西紅花酸對細胞存活率的促進作用最強(P<0.05)。同時，IL-1β處理后凋亡率從(5.34±1.09)%上升至(35.20±2.95)%，用50 μmol/L西紅花酸后細胞凋亡率下降至〔(13.57±1.92)%,P<0.05〕。

2.3西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC炎性因子表達的影響 與對照組相比，IL-1β處理明顯上調細胞中IL-6、TNF-α的轉錄及產(chǎn)生，而西紅花酸處理后可顯著性抑制IL-1β誘導的上述炎性因子的mRNA及釋放(P<0.05)，見表2，表3。

表2 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中IL-6和TNF-α mRNA水平影響

表3 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中IL-6和TNF-α分泌水平影響

2.4西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3、MMP-13表達的影響 與對照組相比，IL-1β組MMP-3、MMP-13的蛋白表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而西紅花酸處理后可顯著性降低IL-1β誘導的MMP-3及MMP-13蛋白表達(P<0.05)。見圖1，表4。

1～3：對照組、IL-1β組、IL-1β+西紅花酸組，下圖同圖1 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3、MMP-13表達的影響

表4 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3和MMP-13蛋白表達水平影響

2.5西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中Collagen Ⅱ及aggrecan轉錄的影響 IL-1β處理顯著性抑制Collagen Ⅱ及aggrecan的mRNA水平(P<0.05)；與IL-1β組相比，西紅花酸處理后細胞中Collagen Ⅱ及aggrecan的mRNA水平明顯增加(P<0.05)。見表5。

表5 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中Collagen Ⅱ、aggrecan mRNA的影響

2.6西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中NF-κB信號通路活化的影響 與對照組相比，IL-1β處理組中p-IκB、p-p65 NF-κB表達水平明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而西紅花酸作用后IL-1β處理的細胞中p-IκB、p-p65 NF-κB的表達水平顯著性降低(P<0.05)，提示西紅花酸可抑制IL-1β誘導的髓核細胞中NF-κB信號通路的活化。見圖2、表6。

圖2 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中NF-κB信號通路活化的影響

表6 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中p-IκB和p-p65蛋白表達水平影響

3 討 論

近年來隨著社會老齡化的加劇，椎間盤突出癥的發(fā)病率逐年上升，是影響中老年腰疼痛的主要因素，已成為影響人類健康的重要問題〔8〕。位于椎間盤中間的NP細胞是IDD的主要參與者，其數(shù)目的減少與IDD進程息息相關〔8，9〕。

在IDD進程中，位于中央的NP組織處于低營養(yǎng)及高IL-1β的炎性應激環(huán)境中〔10〕。多項研究證實，IL-1β是IDD的重要參與者，可通過調控NP細胞的凋亡、炎性因子的產(chǎn)生及胞外基質的降解等加重椎間盤病變進程〔11～13〕。目前，多數(shù)研究已通過IL-1β刺激體外模擬NP細胞退變微環(huán)境〔4，11〕。因此，本研究用IL-1β處理NP細胞，與前期研究類似〔7〕，IL-1β處理抑制了NP細胞的存活，誘發(fā)細胞凋亡。然而，西紅花酸可劑量依賴性上調IL-1β處理的細胞存活率，降低細胞凋亡。楚溪等〔14〕證實，西紅花酸可抑制心肌細胞的氧化應激損傷，從而減緩大鼠心肌缺血性損傷。此外，Wang等〔2〕證實，減緩NP細胞的凋亡及胞外基質的降解有利于減緩IDD進程。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，IL-1β可誘導NP細胞中炎性因子IL-6及IL-8的產(chǎn)生。研究證實，多種促炎性因子如IL-6、IL-1β等參與了IDD及疼痛進程〔3，12〕。已知退變的椎間盤組織可自發(fā)分泌IL-6、IL-8等，從而導致細胞凋亡及基質金屬蛋白抑制因子(TIMPs)的降低或失活，導致MMP-3等大量產(chǎn)生，從而參與IDD調控。而IL-1β是IDD的關鍵炎性因子，不僅可調控炎性因子的產(chǎn)生，還可通過抑制NP細胞存活及MMPs的產(chǎn)生促進胞外基質降解，從而加重IDD〔11～13〕。已知椎間盤胞外基質由Collagen及aggrecan等構成，而退變環(huán)境下大量MMPs的產(chǎn)生及胞外基質合成障礙的發(fā)生導致胞外基質合成及分解平衡被打破，從而引發(fā)IDD。本研究證實，西紅花酸可以抑制IL-1β誘導的MMP-3、MMP-13的表達，同時減緩IL-1β對Collagen Ⅱ及aggrecan表達的抑制效應，提示西紅花酸可調控IL-1β誘導的NP細胞胞外基質代謝紊亂。

NF-κB是已知的重要炎性信號調節(jié)通路，在多種炎性相關疾病中被過度激活，可通過調控存活相關分子、炎癥因子及MMPs等參與多種炎性疾病的調控〔15～17〕。Lu等〔4〕證實，靶向NF-κB通路可抑制IL-1β誘導的胞外基質的降解及NP細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸處理抑制了IL-1β誘導的NP細胞中NF-κB信號通路的活化。Yang等〔18〕證實，西紅花酸可通過抑制NF-κB通路減緩脂多糖LPS誘導的小鼠急性肺損傷。Huang等〔15〕發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB信號通路可減緩小鼠體內的炎癥應答、氧化應激及NP細胞的衰老進程，從而抑制IDD過程。

綜上，一定濃度的西紅花酸對NP細胞無毒性，且可抑制IL-1β誘導的NP細胞凋亡、炎性因子產(chǎn)生及胞外基質的代謝紊亂，且可能是通過阻斷NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。