陳意 許容容

(南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 常州 213000)

肺癌主要采用治療方式為手術聯合化療、放療，新出現的靶向治療對肺癌治療和診斷有積極促進作用〔1，2〕。據報道長鏈非編碼RNA(LncRNA)可參與多種腫瘤的生理、病理發(fā)展，可通過多種作用機制在腫瘤的轉移過程中發(fā)揮重要的調控功能，有望成為新型腫瘤潛在標志物〔3〕。癌易感性候選基因(CASC)19是LncRNA的一種，有研究顯示，CASC19在結直腸癌組織內表達上調，與腫瘤患者臨床癥狀(腫瘤大小、淋巴結轉移及遠處轉移)相關，抑制CASC19能抑制結直腸癌細胞遷移〔4〕。miRNA異常表達與肺癌發(fā)生、發(fā)展和預后及耐藥也密切相關，miRNA可作為肺癌的診斷及治療的特異性靶點并在肺癌早期診斷、治療、預后及發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用〔5〕。研究發(fā)現miR-216a-5p在肺癌患者腫瘤組織中低表達，上調miR-216a-5p表達能通過下調基質金屬蛋白酶(MMP)16表達抑制肺癌細胞侵襲〔6〕。miR-216a-5p通過抑制人類腺胰激肽釋放酶(HK)-2在葡萄膜黑色素瘤中作為腫瘤抑制因子〔7〕。但CASC19和miR-216a-5p二者之間對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲報道進展還不清楚，本研究主要探討CASC19是否能通過調控miR-216a-5p的表達影響肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細胞BEAS-2B和人肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446購自中科院上海生物學研究所；胎牛血清購自Lonsera公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國HyClone公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海全式金生物LipofectamineTM2000轉染試劑購自武漢極捷生物科；Trizol試劑盒購自南京森貝伽生物；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京天根生化公司；Transwell小室購自上海生博生物；Matrigel膠購自上海善然生物；抗體購自北京博奧森生物。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) BEAS-2B細胞和肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446于37℃、5%CO2條件下孵育，細胞接種在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內。待細胞融合80%～85%時，加入胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉染與分組 取SPC-A-1細胞并接種于96孔板中，按照LipofectamineTM2000試劑盒將si-con、si-CASC19、miR-con、miR-216a-5p mimics、pcDNA、pcDNA-CASC19、si-CASC19和anti-miR-con、si-CASC19和anti-miR-216a-5p轉染至細胞內，記為si-con組、si-CASC19組、miR-con組、miR-216a-5p組、pcDNA組、pcDNA-CASC19組、si-CASC19+anti-miR-con組、si-CASC19+anti-miR-216a-5p組。并設置空白對照(NC)組，不進行任何處理。

1.2.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-216a-5p和CASC19表達水平 收集正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞(H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446)及各組細胞，Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明書配制反應體系，于PCR進行PCR擴增。采用2-△△Ct法計算miR-216a-5p和CASC19表達水平。

1.2.4Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、CDK4、MMP-2、MMP-9蛋白的表達 收集NC組、si-con組、si-CASC19組、miR-con組、miR-216a-5p組、si-CASC19+anti-miR-con組、si-CASC19+anti-miR-216a-5p組細胞，加入RIPA裂解液裂解用于提取總蛋白。將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理分離樣品，轉膜，封閉孵育1 h。分別加入稀釋至1∶1 000的一抗(于4℃孵育過夜，加入稀釋至1∶2 000二抗室溫孵育1 h，然后在暗室中曝光顯影、定影。

1.2.5MTT檢測細胞增殖 取NC組、si-con組、si-CASC19組、miR-con組、miR-216a-5p組、si-CASC19+anti-miR-con組、si-CASC19+anti-miR-216a-5p組的細胞，固定時間孵育24 h、48 h、72 h，每孔內添加20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；加入150 μl DMSO，10 min后酶標儀檢測490 nm處吸光度值。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗：取NC組、si-con組、si-CASC19組、miR-con組、miR-216a-5p組、si-CASC19+anti-miR-con組、si-CASC19+anti-miR-216a-5p組細胞，使用不含血清培養(yǎng)基進行重懸細胞。取200 μl細胞懸液接種至Transwell上室中，下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察遷移細胞數。細胞侵襲實驗：采用1∶8比例對Matrigel進行稀釋，然后鋪于Transwell上室內，干燥5 h后，其余按照細胞遷移實驗步驟操作。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測CASC19和miR-216a-5p的靶向關系 數據庫顯示CASC19 3′UTR與miR-216a-5p存在結合位點。然后構建CASC19的野生型和突變型熒光素酶載體(WT-CASC19和MUT-CASC19)，分別轉染miR-con和miR-216a-5p肺癌細胞SPC-A-1。48 h后使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1CASC19和miR-216a-5p在肺癌細胞系中的表達 與正常肺上皮細胞株BEAS-2B相比，肺癌細胞(H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446)中CASC19水平均顯著升高，miR-216a-5p水平均顯著降低(均P<0.05)，見表1。表明肺癌細胞系中CASC19高表達，miR-216a-5p低表達。

表1 CASC19和miR-216a-5p在肺癌細胞系中的表達

2.2干擾CASC19表達對肺癌細胞SPC-A-1增殖的影響 與si-con組及NC組相比，si-CASC19組中CASC19水平、48 h、72 h細胞活性、CyclinD1、CDK4蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。與si-con組miR-216α-5p水平(1.00±0.08)比較，si-CASC19組(5.14±0.42)顯著上升(P<0.05)；見圖1，表2。表明干擾CASC19表達抑制肺癌細胞SPC-A-1增殖。

表2 下調CASC19表達對肺癌細胞SPC-A-1增殖的影響

圖1 Western印跡檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK4和CyclinD1蛋白表達

2.3干擾CASC19表達對肺癌細胞SPC-A-1遷移和侵襲的影響 與si-con組和NC組相比，si-CASC19組遷移和侵襲數目均顯著減少(均P< 0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白均顯著降低(均P<0.05)。見圖2，表3，圖3。表明干擾CASC19表達抑制肺癌細胞SPC-A-1遷移和侵襲。

圖2 檢測肺癌細胞SPC-A-1遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

表3 干擾CASC19對肺癌細胞SPC-A-1遷移、侵襲的影響

圖3 Western印跡檢測肺癌細胞SPC-A-1中MMP-2-及MMP9蛋白表達

2.4CASC19靶向調控miR-216a-5p的表達 通過數據庫預測到CASC19與miR-216a-5p存在結合位點，見圖4。與miR-con組相比，miR-216a-5p組WT-CASC19熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表4。與si-con組miR-216a-5p表達水平(1.00±0.11)相比，si-CASC19組(5.38±0.43)顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組miR-216a-5p表達水平(0.94±0.08)相比，pcDNA-CASC19組(0.38±0.04)顯著降低(P<0.05)，表明CASC19可靶向調控miR-216a-5p的表達。

圖4 CASC19與miR-216a-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達miR-216a-5p對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-con組相比，miR-

216a-5p組中miR-216a-5p表達水平顯著升高(P<0.05)，48 h及72 h細胞活性、CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲數目均顯著降低(P<0.05)，見圖5和表5。表明過表達miR-216a-5p抑制肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移和侵襲。

表5 上調miR-216a-5p對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的影響

圖5 檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK4、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

2.6miR-216a-5p抑制物部分逆轉沉默CASC19表達對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的作用 與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-216a-5p組miR-216a-5p表達水平顯著降低(P<0.05)，48 h及72 h細胞活性、CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達、細胞遷移和侵襲數目均顯著增加(均P<0.05)，見表6、圖6。表明抑制miR-216a-5p部分逆轉沉默CASC19對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移和侵襲的作用。

表6 anti-miR-216a-5p表達逆轉沉默CASC19表達對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的抑制作用

1～2：si-CASC19+anti-miR-con組、si-CASC19+anti-miR-216a-5p組圖6 檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK4、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

3 討 論

肺癌的侵襲與轉移是其惡性標志和特征，也是導致治療失敗和患者死亡的主要原因〔8〕。部分LncRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中異常表達，并參與上皮-間質轉化(EMT)，亦與其他惡性腫瘤的原位侵襲和遠處轉移關系密切〔9〕。CASC19是CASC家族成員之一，研究發(fā)現CASC19通過靶向調控miR-140-5p/CEMIP軸促進結直腸癌細胞的侵襲，遷移和增殖〔10〕。其家族成員CASC15通過表觀遺傳調節(jié)PDCD4促進黑素瘤進展〔11〕；CASC15在肝癌上調并促進肝癌發(fā)生〔12〕；CASC15還可調節(jié)胃癌細胞增殖、遷移和上皮間質轉化〔13〕。本研究結果再次證實CASC19在腫瘤中起著促癌的作用。

miRNA作為一種非編碼小分子RNA，現已被證實miRNA可通過調控EMT參與肺癌侵襲轉移〔14〕。miR-216a-5p通過調控Bcl-2家族蛋白抑制小細胞肺癌的惡性進展〔15〕；miR-216a-5p在多種膀胱癌細胞系中低表達，可在體外靶向抑制PAK2基因，抑制膀胱癌細胞系5637和J82的增殖能力，促進細胞凋亡〔16〕。miR-216a過表達抑制了結直腸癌轉移〔17〕。本實驗結果說明過表達miR-216a-5p能抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。且有研究報道Lnc RNA HOTTIP通過調控miR-216a-5p促進前列腺癌細胞的增殖和遷移〔18〕。Lnc RNA SNHG16通過miR-216-5p/ZEB1信號通路調節(jié)宮頸癌的發(fā)生〔19〕。本研究結果說明CASC19可能通過調控miR-216a-5p影響肺癌惡性發(fā)展。

綜上，CASC19在肺癌細胞中表達上調，干擾CASC19可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與過表達miR-216a-5p相關。