陳燕 童天夫 許立新 田志明 吳培

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 1江北院區(qū)檢驗科，江蘇 南京 210044；2江北院區(qū)介入科；3感染科)

乙型肝炎病毒(HBV)持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的主要因素〔1,2〕。HBV X蛋白(HBx)的反式激活對肝癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義，但其致癌的分子機制尚不清楚〔3〕。臨床化療是治療肝癌不可或缺的方法，但有毒副作用，且極易形成耐藥性從而阻礙化療藥物持續(xù)發(fā)揮作用，中醫(yī)藥有天然、毒副作用小等優(yōu)點，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤研究日益增多〔4,5〕，尋求療效顯著的中藥治療肝癌逐漸成為研究熱點。白楊素是黃岑、南棗酸、木蝴蝶等許多中藥的活性成分，研究顯示白楊素可抑制小細(xì)胞肺癌〔6〕發(fā)生，但關(guān)于白楊素在抑制HBx誘導(dǎo)的肝癌生長研究較少。研究顯示，磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，miR-103是PTEN的靶基因，李明等〔7〕研究顯示，miR-103在肝癌癌組織中異常表達(dá)。本研究主要通過觀察白楊素對轉(zhuǎn)染HBx蛋白的肝癌細(xì)胞系HepG2增殖、凋亡變化，探討白楊素對HBx-HepG2增殖、凋亡的影響及可能的作用途徑，以期為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑及儀器 白楊素購自上海源葉生物科技有限公司(批號B20063-20 mg，純度>98%)；人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；攜帶HBx基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒由本室構(gòu)建提供；Trizol、BCA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒試劑、Hoechest33258熒光染色試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物技術(shù)有限公司；CCK-8實驗相關(guān)試劑購自美國Promega公司；鼠源一抗〔Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、PTEN、GAPDH〕、二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠〕購自美國Cell Signal Technology公司。CO2培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司；Elx800酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞株制備 自液氮罐中取出凍存的HepG2細(xì)胞株，快速解凍復(fù)蘇后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后加入含有攜帶HBx基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，3 h后，加入RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。當(dāng)轉(zhuǎn)染率70%時，加入嘌呤霉素進行壓力篩選，獲HBx-HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞與HBx-HepG2增殖能力。

1.2.2不同濃度白楊素處理HBx-HepG2 取1.2.1中對數(shù)期HBx-HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個/ml并接種于96孔板中，每孔加入180 μl，加入終濃度分別為0、10、20、40、80 μmol/L的白楊素繼續(xù)培養(yǎng)，HepG2細(xì)胞組加入相同體積的含終濃度為0.1% DMSO的RPMI1640培養(yǎng)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，處理48 h后，CKK-8法檢測HBx-HepG2細(xì)胞生長情況，細(xì)胞增殖抑制率=〔1-A藥物處理組/A未HepG2細(xì)胞組〕×100%〔8〕，實驗重復(fù)3次，求平均值。

1.2.3細(xì)胞分組 分為HepG2組：含0.1% DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞；HBx-HepG2組：含0.1% DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)HBx-HepG2細(xì)胞；各劑量白楊素組：分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的白楊素培養(yǎng)HBx-HepG2細(xì)胞。

1.2.4平板克隆法檢測白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞增殖的影響 收集1.2.3中各組細(xì)胞，按照文獻(xiàn)〔9〕方法進行平板克隆試驗，并用含1%結(jié)晶紫溶液染色20 min后，流水沖洗染色液，空氣干燥，拍照統(tǒng)計細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.2.5Hoechest33258熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡形態(tài) 收集1.2.3中各組細(xì)胞，按照Hoechest33258熒光染色說明書操作，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6流式AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組HBx-HepG2細(xì)胞凋亡情況 收集1.2.3中各組細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書進行操作，上流式細(xì)胞儀進行檢測，通過Modfir LT軟件分析試驗結(jié)果。

1.2.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測miR-103、PTEN mRNA表達(dá)情況 收集1.2.3中各組細(xì)胞，分別按照Trizol試劑盒操作說明書、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作提取細(xì)胞總RNA、將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量PCR試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。上熒光定量PCR儀檢測，程序設(shè)定為：95℃預(yù)處理5 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，以上三步驟共循環(huán)40次。miR-103以U6為內(nèi)參基因，PTEN以GAPDH為從內(nèi)參基因引物由北京優(yōu)博蘭基因公司合成，miR-103：正向序列：5'-GCGCATCGTTACCATCATCACG-3',反向序列：5'-TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT-3';U6：正向序列：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；PTEN：正向序列：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向序列：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；GAPDH：正向序列：5'-CACGCACTTCCGCACATTCC-3'，反向序列：5'-TCCAGCAGCTCGAAGAGGCA-3'。反應(yīng)結(jié)束后通過2-ΔΔCt法計算miR-103、PTEN mRNA相對表達(dá)量。

1.2.8Western印跡檢測Ki67、Caspase-3、PTEN蛋白表達(dá) 收集1.2.3中各組細(xì)胞，加入蛋白裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒測定細(xì)胞總蛋白含量。經(jīng)過轉(zhuǎn)模、封閉后，添加(1∶500)鼠抗人Ki67、Caspase-3、PTEN一抗，放置4℃過夜，清洗后添加二抗稀釋液放置37℃中孵育2 h，經(jīng)ECL顯色后，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)，并保存圖像。均以GAPDH蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1上調(diào)HBx表達(dá)對肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖影響 培養(yǎng)時間分別為0、24、48、72、96 h，HepG2組的OD值分別為〔(0.19±0.01)、(0.41±0.02)、(0.69±0.02)、(1.03±0.03)、(1.05±0.03)〕，HBx-HepG2組的OD值分別為〔(0.19±0.01)、(0.41±0.01)、(1.11±0.03)、(1.64±0.06)、(1.71±0.04)〕。與HepG2組相比，HBx-HepG2組細(xì)胞48、72、96 h OD值顯著升高(P<0.05)。

2.2白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞增殖抑制率的影響 作用48 h后，與0 μmol/L白楊素組〔(4.98±0.01)%〕相比，10 μmol/L白楊素組〔(5.00±0.02)%〕對HBx-HepG2細(xì)胞增殖抑制率差異不顯著(P>0.05)，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L白楊素組〔(23.45±1.22)%、(38.75±1.84)%、(50.10±2.02)%〕對HBx-HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著增加，且兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此后續(xù)選擇20、40、80 μmol/L白楊素處理48 h。

2.3白楊素對HBx-HepG2增殖影響 與HepG2組細(xì)胞克隆數(shù)目〔(172.54±18.95)個〕相比，HBx-HepG2組〔(209.83±41.96)個〕顯著增加(P<0.05)；與HBx-HepG2組相比，20、40、80 μmol/L白楊素組〔(201.32±40.33)、(176.55±35.29)、(131.91±26.38)個〕依次下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 平板克隆法檢測白楊素對HBx-HepG2增殖影響

2.4白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞凋亡的影響 與HepG2組、HBx-HepG2組相比，20、40、80 μmol/L白楊素組細(xì)胞形態(tài)變化顯著，發(fā)生核固縮、核裂變等改變，正常形態(tài)細(xì)胞明顯較少，凋亡細(xì)胞明顯增加，見圖2。

圖2 白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst33258熒光染色，×400)

與HepG2組細(xì)胞凋亡率〔(3.8±0.7)%〕相比，HBx-HepG2組〔(1.7±0.3)%〕顯著降低(P<0.05)，20、40、80 μmol/L白楊素組細(xì)胞凋亡率依次升高〔(14.2±2.8)、(17.6±4.3)、(20.0±4.1)%，P<0.05〕。見圖3。

圖3 流式AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

2.5白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與HepG2組相比，HBx-HepG2組Ki67蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，20、40、80 μmol/L白楊素組Ki67蛋白表達(dá)依次下降(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達(dá)依次升高(P<0.05)。見圖4、表1。

1～5：HepG2組，HBx-HepG2組，20 μmol/L白楊素組，40 μmol/L白楊素組，80 μmol/L白楊素組，下圖同圖4 白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞Ki67、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表1 白楊素對HBx-HepG2細(xì)胞Ki67、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.6白楊素對miR-103、PTEN mRNA與蛋白表達(dá)的影響 與HepG2組相比，HBx-HepG2組miR-103表達(dá)顯著升高(P<0.05)，PTEN mRNA、PTEN蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，20、40、80 μmol/L白楊素組miR-103表達(dá)依次降低(均P<0.05)，PTEN mRNA、PTEN蛋白表達(dá)依次升高(均P<0.05)。見表2、圖5。

表2 白楊素對mir-103、PTEN mRNA與蛋白表達(dá)的影響

1～5：HepG2組，HBx-HepG2組，20 μmol/L白楊素組，40 μmol/L白楊素組，80 μmol/L白楊素組圖5 白楊素對miR-103、PTEN mRNA與蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤，HBV感染是引起原發(fā)性肝癌的重要原因之一，HBV病毒可產(chǎn)生HBx蛋白，研究顯示HBx蛋白與肝癌的增殖、凋亡過程密切相關(guān)〔10〕。HBx是有多種生物活性的蛋白質(zhì)，攜帶HBx基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染肝細(xì)胞后，可促進HBV在肝細(xì)胞中的復(fù)制和傳播，進而使得宿主細(xì)胞免疫失效〔11〕。林松挺等〔12〕研究表明，轉(zhuǎn)染HBx病毒后，肝癌細(xì)胞株Bel-7404細(xì)胞增殖能力顯著增強，與細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生相關(guān)。

化療是治療肝癌的主要手段之一，但會產(chǎn)生骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、器官毒性等毒副作用，且易形成耐藥性阻礙化療藥物持續(xù)發(fā)揮作用。中醫(yī)藥有毒副作用小等天然優(yōu)勢，白楊素是一種化學(xué)名為5，7-二羥黃酮的黃酮類物質(zhì)，是黃岑、南棗酸、木蝴蝶等許多中藥的活性成分，在蜂蜜及蜂膠中含量豐富，研究顯示白楊素及其衍生物有抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤凋亡的潛能〔13〕。本研究結(jié)果提示白楊素可抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖，且隨白楊素濃度增加；白楊素可抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖能力。Ki67在細(xì)胞周期M期表達(dá)最高，與細(xì)胞合成代謝密切相關(guān)〔14〕，提示白楊素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡是肝癌發(fā)生發(fā)展進程中的重要環(huán)節(jié)，本研究提示白楊素處理可劑量依賴地誘導(dǎo)HBx-HepG2細(xì)胞凋亡。Ahuja等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3抑制劑DEVD-CHO能抑制HepG2肝癌細(xì)胞凋亡，表明Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究提示白楊素可能通過調(diào)控Caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HBx-HepG2細(xì)胞凋亡。

PTEN是常見的突變抑癌基因，研究顯示，人原發(fā)性肝癌組織中PTEN在基因、蛋白水平均呈低表達(dá)狀態(tài)，體外實驗顯示PTEN低表達(dá)可促進肝癌細(xì)胞增殖，提示PTEN在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔16～18〕。蔡岳等〔19〕研究表明，皂莢提取物可能通過促進PTEN表達(dá)抑制大鼠肝癌細(xì)胞增殖過程。Cang等〔20〕通過雙熒光素報告證實miR-103是PTEN的靶基因之一。本研究提示白楊素可能通過下調(diào)miR-103表達(dá)進而促進PTEN表達(dá)，抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖，促進HBx-HepG2細(xì)胞凋亡。