吳亞東 趙科 尹鑫海 黃光磊 林渡人 羅洪

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州 貴陽 550004；2貴州省人民醫(yī)院口腔頜面外科；3貴陽市第二人民醫(yī)院(金陽醫(yī)院)口腔科)

涎腺癌是口腔頜面頭頸部較為常見的上皮性癌，好發(fā)于腮腺、下頜下腺、舌下腺及口腔的小涎腺，也可見于鼻腔、咽部及淚腺等。涎腺癌的主要治療手段為擴(kuò)大切除，但擴(kuò)大切除往往需要犧牲面神經(jīng)、舌神經(jīng)、舌下神經(jīng)等重要的解剖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面癱、舌麻木、舌運(yùn)動(dòng)障礙等嚴(yán)重的并發(fā)癥。即便如此，由于口腔頜面頭頸部的解剖限制，涎腺癌的擴(kuò)大切除范圍往往存在不足，從而導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)率較高。研究表明，術(shù)后放療可以降低涎腺癌患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)率和提高患者生存率〔1〕。近年來，放射性125I粒子組織間植入近距離治療涎腺癌取得了令人滿意的療效〔2〕。但是查閱文獻(xiàn)沒有發(fā)現(xiàn)針對(duì)放射性125I粒子近距離治療涎腺癌生物效應(yīng)和處方劑量的研究，在實(shí)際的臨床工作中，人們對(duì)于放射性125I粒子近距離治療涎腺癌的處方劑量存在較大差異，這會(huì)造成治療劑量不足或因超治療劑量導(dǎo)致影響療效及增加并發(fā)癥。美國(guó)放射學(xué)會(huì)(ACR)和美國(guó)近距離放療學(xué)會(huì)(ABS)根據(jù)大量的文獻(xiàn)回顧和系統(tǒng)評(píng)價(jià)，推薦125I粒子近距離治療前列腺癌的處方劑量是140～160 Gy〔3〕。本研究建立放射性125I粒子體外照射細(xì)胞模型，通過對(duì)比125I照射涎腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞的存活曲線和放射生物學(xué)參數(shù)，根據(jù)ABS推薦125I粒子近距離治療前列腺癌的處方劑量來推算出治療涎腺腺樣囊性癌的處方劑量，從而對(duì)臨床125I粒子近距離治療涎腺癌給予適當(dāng)?shù)奶幏絼┝刻峁?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系和試劑 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人腺樣囊性癌ACC-2及人前列腺癌PC-3細(xì)胞系(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫,ATCC)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min后重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞濃度，梯度稀釋。然后將合適數(shù)量的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含有10%胎牛血清(四季青公司)、青霉素100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))置于37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2離體照射模型 離體照射模型參照英國(guó)GARY實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的粒子離體照射細(xì)胞研究系統(tǒng)〔4〕，2 mm厚聚甲丙烯酸甲酯板支架，分為上下兩層，上層為細(xì)胞培養(yǎng)板，下層為粒子盤。將8枚7611型125I粒子(江蘇華益生物公司)按等距離分布直徑3 cm的圓周上，圓心放置1枚粒子。125I粒子的活度為37 MBq(1 mCi)，111 MBq(3 mCi)，模型如圖1。根據(jù)蒙特卡洛建模模擬方法推算出在該離體照射模型下細(xì)胞分別受到2、4、6、8、10 Gy所需要的照射時(shí)間如表1。高劑量率分隔外照射組使用RS-2000Pro生物學(xué)X射線輻射儀(美國(guó))，能量為250 KeV，劑量率為50 cGy/min。

(a)參照英國(guó)GARY實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的粒子離體照射細(xì)胞研究系統(tǒng)〔4〕；(b)放射性粒子分布〔4〕；(c)實(shí)驗(yàn)中所使用的照射模型和放射屏蔽防護(hù)裝置圖1 放射性125I粒子持續(xù)低劑量率體外照射細(xì)胞模型

表1 放射性125I粒子照射時(shí)間

1.3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將合適數(shù)量的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別給予X線分割照射(X線組)和125I持續(xù)低劑量率照射(125I-CLDR組)：0、2、4、6、8和10 Gy劑量照射，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣本。照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，甲醇固定，瑞氏姬姆薩染色，蒸餾水漂洗1～2遍。常規(guī)顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)，分別計(jì)算X線組與125I-CLDR組各劑量點(diǎn)的接種效率(PE)和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)。PE=(克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù))×100%，SF=(克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)×PE)×100%。根據(jù)單擊多靶模型y=1-〔1-exp(-k×x)〕^N〔5〕，采用兩照射組2 Gy劑量點(diǎn)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之比估算相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)RBE=SF2(X線)/SF2(125I)。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用Graphpad prism7.0分別對(duì)結(jié)果按照單擊多靶模型y=1-〔1-exp(-k×x)〕^N，擬合細(xì)胞存活曲線，分別計(jì)算出各自的D0、N、Dq、D37和SF2。應(yīng)用SPSS21.0軟件分別對(duì)ACC-2細(xì)胞125I組和X線組，PC-3細(xì)胞125I組不同劑量點(diǎn)的細(xì)胞克隆形成率進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差檢驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞存活曲線進(jìn)行擬合優(yōu)度檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PC-3和ACC-2細(xì)胞受兩種射線照射后增殖能力 隨著時(shí)間和照射劑量的增加，PC-3細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞的接種效率明顯下降。見圖2。不同劑量組總體均值間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC-3細(xì)胞接種效率(除劑量10 Gy外)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同射線及照射劑量下PC-3細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞接種效率

2.2PC-3 和ACC-2 細(xì)胞分別受到不同劑量的125I粒子和X線照射后劑量存活率比較將兩種細(xì)胞的分別受到不同劑量和照射方式的細(xì)胞存活率進(jìn)行劑量生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)在隨著照射劑量的增大細(xì)胞存活率下降，至6 Gy時(shí)，細(xì)胞存活率急劇下降，至10 Gy時(shí)幾乎沒有細(xì)胞存活。在2 Gy和4 Gy劑量組，PC-3細(xì)胞受到X線分割照射的細(xì)胞存活率明顯高于125I-CLDR組(P<0.05)。見表3。根據(jù)單擊多靶模型，PC-3細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞在分別接受X線和125I照射后的D0、N、Dq、D37、SF2各組間PC-3、ACC-2差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 PC-3和ACC-2細(xì)胞分別受到不同劑量的125 I粒子和X線照射后劑量存活率

表4 PC-3和ACC-2細(xì)胞受X線和125I照射后的放射生物學(xué)參數(shù)

2.3PC-3和ACC-2的相對(duì)生物效應(yīng)(RBE) ACC-2受到放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射相對(duì)于250 KeV的X線分割照射的RBE為1.28，PC-3的RBE為1.07。

(a)ACC-2細(xì)胞受不同劑量放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射后的細(xì)胞克隆形成情況；(b)ACC-2細(xì)胞受不同劑量X線照射后的細(xì)胞克隆形成情況；(c)PC-3細(xì)胞受不同劑量放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射后的細(xì)胞克隆形成情況；(d)PC-3細(xì)胞受不同劑量X線照射后的細(xì)胞克隆形成情況圖2 PC-3和ACC-2細(xì)胞分別受到不同劑量的125I粒子和X線照射后細(xì)胞克隆形成情況

2.4ACC-2細(xì)胞受125I粒子照射處方劑量的推算 在PC-3和ACC-2細(xì)胞受到放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射的細(xì)胞生存曲線上，選取細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為0.1(即被射線照射后細(xì)胞存活率為10%)的劑量點(diǎn)作為生物學(xué)參考點(diǎn)，ACC-2細(xì)胞所需的劑量為4.75 Gy，PC-3所需要的劑量為4.02 Gy，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=1.85，P=0.14，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此可以間接推導(dǎo)出放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞的處方劑量應(yīng)該與照射前列腺癌PC-3細(xì)胞相當(dāng)，為140～160 Gy。

3 討 論

腺樣囊性癌占口腔頜面部惡性腫瘤的15%～25%，占涎腺腫瘤的10%〔6〕，是舌下腺和小涎腺最常見的惡性腫瘤，除此之外，腺樣囊性癌也可發(fā)生在淚腺〔7〕、耵聹腺〔8〕、鼻腔鼻竇〔9〕、咽喉〔10〕、支氣管〔11〕等部位。腺樣囊性癌侵襲性強(qiáng)，早期極易侵犯神經(jīng)和血管，其主要治療手段為手術(shù)根治配合術(shù)后放射治療，但是由于其侵襲性強(qiáng)及頭頸部解剖條件的限制，對(duì)于較大范圍的腺樣囊性癌很難做到完全根治，因此術(shù)后輔以放療十分有必要。Harrison等〔12〕研究對(duì)涎腺高度惡性病變的患者手術(shù)加放療組比單獨(dú)手術(shù)組5年生存率明顯提高，分別為57%和28%，局部控制率分別為63%和40%。Yu等〔13〕對(duì)405例涎腺癌分析結(jié)果表明，單獨(dú)分析腺樣囊性癌，單純手術(shù)者5年和10年生存率分別為56.6%及34.5%，而手術(shù)結(jié)合放療組其5年和10年生存率分別為93.3%和68%。因此，術(shù)后放療是降低腺樣囊性癌的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存率的重要手段。但是傳統(tǒng)的外照射由于照射面積過大，對(duì)周圍正常組織的損傷不可避免，由此造成的放射性骨髓炎、皮炎、黏膜炎、器官功能減退等副作用使患者苦不堪言。放射性粒子植入要求靶區(qū)達(dá)到很高的根治腫瘤的處方劑量(PD),要求治療靶區(qū)的邊緣必須匹配達(dá)到PD，而周圍正常組織，受到較少的輻射損傷，因此放射性粒子植入治療本質(zhì)上就是一種精確放療。從臨床實(shí)踐比較，放射性粒子植入治療具極好的適形性，靶區(qū)PD可能要高于外照射時(shí)的劑量，對(duì)腫瘤的局部控制療效更好。放射性125I是目前臨床應(yīng)用最廣泛的放射性核素之一，其半衰期為59.4 d，在其衰變過程主要產(chǎn)生27 KeV、31 KeV的X射線和35 KeV的γ射線。1965年美國(guó)的Memorial Sloan-Kettering 癌癥中心率先對(duì)124例晚期頭頸部復(fù)發(fā)癌進(jìn)行了125I粒子植入治療。隨后，這種放射性粒子被廣泛應(yīng)用于前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌等各種類型腫瘤的治療〔14〕。國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者醫(yī)生使用這一技術(shù)治療涎腺癌，取得了良好的效果。Stannard等〔15〕對(duì)9例腭部小涎腺癌術(shù)后切緣陽性的患者加用125I粒子治療，隨訪時(shí)間32～158個(gè)月，獲得了100%的局部控制率。北京大學(xué)口腔醫(yī)院〔16～18〕用放射性125I粒子植入治療以涎腺癌為主的口腔頜面部惡性腫瘤，取得了良好的效果。本課題組團(tuán)隊(duì)從2006年開始利用放射性125I粒子植入近距離治療以涎腺癌為主的頭頸部惡性腫瘤，到目前為止，取得了令人滿意的療效〔19,20〕。

本研究表明，放射生物學(xué)中細(xì)胞受電離輻射照射后，受照射細(xì)胞既可以呈現(xiàn)即刻死亡，也可能延遲一段時(shí)間后才表現(xiàn)出死亡，即增殖環(huán)節(jié)出現(xiàn)的細(xì)胞死亡，稱為細(xì)胞增殖性死亡。一般而言，細(xì)胞增殖性死亡是不能經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)、LDH漏出實(shí)驗(yàn)或臺(tái)盼藍(lán)拒染法等加以檢測(cè)。放射生物學(xué)上，人們通常采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)電離輻射照射后，細(xì)胞在克隆性細(xì)胞增殖能力上的變化。顯而易見，細(xì)胞死亡的程度與細(xì)胞受照射劑量的大小直接相關(guān)，在放射生物學(xué)中細(xì)胞死亡程度更多采用細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)來表示。哺乳類細(xì)胞受照射后，單擊多靶數(shù)學(xué)模型能較好地說明這種細(xì)胞存活與受照劑量之間相關(guān)性的數(shù)學(xué)規(guī)律。因此我們采用單擊多靶數(shù)學(xué)模型對(duì)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與受照劑量各自之間的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，從而獲得細(xì)胞存活曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式及其一些重要的參數(shù)，如k、N、D0、Dq、SF2等。在單擊多靶細(xì)胞存活模型中，k為細(xì)胞存活曲線的鈍化常數(shù)，其值由擬合方程直接給出；N為外推數(shù)，理論上代表靶的數(shù)目，數(shù)值大小也是由擬合方程直接給出；D0為平均致死劑量，理論上D0是使每個(gè)細(xì)胞平均被擊中一次所需要的輻射劑量，數(shù)值上D0=1/k；Dq為準(zhǔn)閾劑量，代表修復(fù)亞致死損傷的能力，Dq值反映了細(xì)胞抵抗電離輻射修復(fù)亞致死性細(xì)胞損傷能力的大小，數(shù)值上Dq=lnN×D0；D37是細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)相應(yīng)于37%時(shí)所需要的輻射劑量，在單擊多靶模型中D37=D0+Dq。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明125I放射性粒子照射下的細(xì)胞存活曲線“肩區(qū)”大于X線的，反映了125I粒子照射克服“肩區(qū)”所需要的劑量大，積累亞致死損傷的能力弱。根據(jù)2018年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)發(fā)布的頭頸腫瘤臨床實(shí)踐指南〔21〕，涎腺惡性腫瘤原發(fā)灶的根治性外放療應(yīng)≥70 Gy(1.8～2.0 Gy/次)，術(shù)后放療應(yīng)≥60 Gy(1.8～2.0 Gy/次)。而臨床上對(duì)于放射性125I粒子植入持續(xù)低劑量率治療涎腺癌，處方劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外照射劑量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

RBE是比較不同的射線產(chǎn)生相同的生物學(xué)效應(yīng)的一個(gè)直觀指標(biāo)。通常以250 KeV的X射線為標(biāo)準(zhǔn)。X射線引起某種生物學(xué)效應(yīng)所需要的吸收劑量與研究的電離輻射引起相同的生物學(xué)效應(yīng)所需吸收劑量的比值，即為該種電離輻射的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)。Marchese等〔22,23〕的研究證實(shí)，盡管實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞系以及生物檢測(cè)系統(tǒng)不盡相同，放射性125I粒子在相對(duì)于192Ir、60Co、226Ra、137Csγ射線，其RBE值位于1.0～1.5之間，范圍卻大致相同。Nath等〔24〕對(duì)中國(guó)倉鼠肺細(xì)胞系(CCL-16)進(jìn)行照射，125I相對(duì)與250 KeV X線的RBE為1.08。可見不同的研究者們?cè)谝欢ǖ膭┝柯史秶鷥?nèi)，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得出的RBE均相應(yīng)的位于一定的范圍內(nèi)。本研究說明125I在不同癌細(xì)胞的放射生物效應(yīng)相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中125I照射腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞和照射前列腺癌PC-3細(xì)胞的放射生物參數(shù)近似，因此可以間接推導(dǎo)出125I粒子治療腺樣囊性癌的PD，即ABS推薦125I粒子治療前列腺癌140～160 Gy的PD作為治療腺樣囊性癌的PD。

本實(shí)驗(yàn)從單一的細(xì)胞系受到放射性125I粒子持續(xù)低劑量率照射和X線照射的體外模型進(jìn)行處方劑量的推導(dǎo)具有理論意義，但是，其精確性還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)和大量的臨床病例進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，放射性125I粒子組織間植入近距離治療涎腺癌已經(jīng)被證明在抑制腫瘤增殖方面具有顯著療效，進(jìn)一步研究其作用的分子機(jī)制及治療不同病理類型的涎腺腫瘤的最佳處方劑量是今后應(yīng)該亟待解決的課題。