武小雯，張新亭，常宇陽，汪絲雨，陳良標(biāo)，關(guān)桂君

(1. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

脊椎動(dòng)物的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGC)，從未分化的I型到進(jìn)入雌雄各異的II型分裂活躍期，最終發(fā)育成雌雄配子的分子機(jī)制仍然不明[1]。青鳉(Oryziaslatipes)Y染色體存在雄性決定基因dmy[2-3]能直接調(diào)控體細(xì)胞衍生因子(Gonadal soma derived factor，gsdf)，一種轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，開啟/關(guān)閉青鳉雄性配子發(fā)生和發(fā)育[4-5]。敲除gsdf后產(chǎn)生gsdf-/-XY卵巢[5]，且伴有大量發(fā)育停滯的初級(jí)卵母細(xì)胞[6]。研究發(fā)現(xiàn)gsdf-/-XY的青鳉卵巢中有異質(zhì)型生殖細(xì)胞的囊性分裂簇[7]，并觀察到組蛋白三甲基化H3K27me3表達(dá)陽性和陰性兩種粗線期生殖細(xì)胞，即非姐妹染色體DNA重組時(shí)或之前已具有雌雄分化特征[7]。小鼠H3K27me3是胚胎期生殖細(xì)胞進(jìn)入雌性分化和減數(shù)分裂的標(biāo)記物之一，并在X-染色體失活和染色體重組中起重要調(diào)控作用[8-9]，因此推測(cè)gsdf可能具有選擇性抑制XY型生殖細(xì)胞雌性發(fā)育的功能。

蛋白組學(xué)比對(duì)分析結(jié)果顯示，真核翻譯延伸因子1(Eukaryotic translation elongation factor 1a,eEF1a)家族中的卵巢型基因42Sp50在gsdf-/-卵巢中的表達(dá)顯著升高[7]。eEF1a能夠結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn) tRNA 到核糖體[10]，并能夠與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體發(fā)揮作用[11]。青鳉42Sp50是青鳉胚胎期性腺雌性分化的最早標(biāo)志物之一[12]，參與卵細(xì)胞生成和發(fā)育的整個(gè)過程[13]。非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[14]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[15]的研究結(jié)果顯示42Sp50同卵母細(xì)胞發(fā)育必需的雌性因子合成和代謝，雌激素代謝的維持和降解等密切相關(guān)。

為研究42Sp50和eEF1a在雌雄配子發(fā)育中的作用，本研究在蛋白組學(xué)比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，用實(shí)時(shí)定量qPCR和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，比較并分析了正常和gsdf缺失性腺eEF1a和42Sp50在性分化和性成熟期性腺中的雌雄表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

青鳉野生型和gsdf-/-純合子突變體，喂養(yǎng)在上海海洋大學(xué)青鳉研究魚房循環(huán)水系統(tǒng)中。水環(huán)境為淡水，pH 7,水溫維持在24 ℃～25 ℃，光周期為14 h光照和10 h黑暗。每日產(chǎn)卵，魚卵在27 ℃±2 ℃環(huán)境下孵育，受精后10 ～ 12 d出殼。本試驗(yàn)所需的gsdf-/-青鳉通過合成鋅指酶(ZFN)基因編輯技術(shù)獲得[16]。

1.2 方法

1.2.1 青鳉eEF1a和42Sp50基因序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫查詢青鳉eEF1a(ID 100049188)和eEF1a的卵巢異構(gòu)體42Sp50(ID 100049338)的基因全長以及氨基酸序列，并對(duì)基因組進(jìn)行線性分析，利用GSDS網(wǎng)站比較青鳉eEF1a和42Sp50外顯子模式圖，利用Vector NTI對(duì)比基因序列以及氨基酸序列，分析相似度。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析

提取組織總RNA(Trizol，LifeScience)，并用oligo-dT(18)引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara，中國)逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。表1中列出了擴(kuò)增42Sp50 和β-actincDNA的引物。采用SYBR Fast qPCR mix(Takara，China)，在7500型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析。qPCR結(jié)果經(jīng)過管家基因-肌動(dòng)蛋白的qPCR結(jié)果(內(nèi)參)標(biāo)準(zhǔn)定量，得到相對(duì)表達(dá)值。通過對(duì)各組相對(duì)表達(dá)值的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05時(shí)呈顯著差異。數(shù)據(jù)來自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的各3次以上重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 qPCR分析的基因及其引物

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采集3月齡性成熟成年個(gè)體(3 mon)的性腺3～5個(gè)，混合組成正常對(duì)照組(野生型XX卵巢和XY精巢)，以及gsdf缺失XY卵巢組，以避免個(gè)體差異的影響。Label Free蛋白組學(xué)及質(zhì)譜定量比對(duì)和數(shù)據(jù)的生物信息分析，參考文獻(xiàn)[7]。用DAVID分類工具和已有的Oryziaslatipes的uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了基因GO和KEGG通路的注釋和富集分析。對(duì)4批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)交集中2 556個(gè)有效總蛋白進(jìn)行聚類分析，依據(jù)Euclidean distance和complete linkage clustering算法對(duì)所有類別及其P值針對(duì)這些類別進(jìn)行了過濾，這些類別中至少1個(gè)聚類的P<0.05。使用函數(shù)x=-log10(P值)轉(zhuǎn)換此濾波后的P值矩陣。最后，對(duì)每個(gè)功能類別，將x值進(jìn)行z轉(zhuǎn)換。通過單向?qū)哟尉垲?歐幾里得距離，平均鏈接聚類)以z得分聚類[7, 16]。

1.2.4 免疫熒光分析

將性腺組織切塊放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛(PFA)固定液中固定后，經(jīng)常規(guī)的體積分?jǐn)?shù)50%至100%酒精系列脫水處理，浸蠟包埋，再用組織切片儀(LeicaRM2265，德國)制備6 μm的石蠟切片。42 ℃烘片固定3 h后，經(jīng)脫蠟和酒精梯度復(fù)水，體積分?jǐn)?shù)0.1%曲拉通-100(生工，中國)增強(qiáng)細(xì)胞通透性，用體積分?jǐn)?shù)為5%的羊血清(生工，中國)進(jìn)行非特異性抗原封閉處理(室溫避光濕盒中1 h)后，用抗人EEF1A和H3K27me3作為一抗(1∶ 200封閉液稀釋)覆蓋整個(gè)組織并4 ℃孵育過夜。青鳉和人的EEF1A的氨基酸序列高度相似(92%)，抗人H3K27me3抗體的特異性在文獻(xiàn)[7]中已討論，均可適用于青鳉。次日分別進(jìn)行二抗(1∶ 1 000封閉液稀釋)孵育(抗體詳細(xì)信息參見表2)；用TSA TM-Plus TMR/Fluorescein System進(jìn)行熒光信號(hào)放大增強(qiáng)(PerkinElmer，德國)；用DAPI復(fù)染細(xì)胞核(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，Sigma，美國)；加FluoroshieldTM(Sigma，美國)熒光淬滅抑制劑，并用蓋玻片和透明指甲油封片，在共聚焦激光掃描顯微鏡(DMi8 TCS SP8，德國徠卡)下觀察熒光信號(hào)并拍攝圖像。

表2 免疫組化實(shí)驗(yàn)所需抗體信息

2 結(jié)果與分析

2.1 青鳉eEF1a和42Sp50基因在功能域和核糖體結(jié)合部位上的差異分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫查詢得到青鳉eEF1a和42Sp50序列分析都有7個(gè)外顯子，每一個(gè)外顯子的長度一樣[圖1(a)]，基因結(jié)構(gòu)保守。青鳉中的eEF1a有兩種編碼區(qū)cds序列，eEF1a(103)和eEF1a(102)，這兩種序列具有12個(gè)核酸堿基突變位點(diǎn)，但每個(gè)突變位點(diǎn)都是單個(gè)核苷酸的突變，其氨基酸的翻譯不受影響，屬于無義突變，兩者最終都編碼序列完全一樣的462個(gè)氨基酸(圖2)。42Sp50編碼457個(gè)氨基酸，與eEF1a編碼的氨基酸序列呈68.2%相似(圖2)。

比較基因組的進(jìn)化線形分析顯示，青鳉42Sp50和eEF1a分別在15號(hào)和11號(hào)染色體上。42Sp50同ddx43、kcnq5、slc17a5和map3k4共線形連鎖片段，存在于人6號(hào)染色體的對(duì)應(yīng)區(qū)域，而eEF1a周圍的slc9A1和kdm1b也可以在人6號(hào)染色體EEF1A的附近找到[圖1(b)]。由此推斷，42Sp50和eEF1a可能是經(jīng)過硬骨魚基因組擴(kuò)增后產(chǎn)生的兩個(gè)復(fù)制，同人6號(hào)染色體的EEF1A1附近的片段，起源于同一個(gè)共同祖先。

G結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)合基序用紅色框出； 蛋白結(jié)合集團(tuán)(橙色下劃線)；氨基酰基結(jié)合囊(藍(lán)色下劃線)；核糖體結(jié)合部位(綠色下劃線)；eEF1a和42Sp50的氨基酸差異(星號(hào)*)[18]。

(a)青鳉中42Sp50和eEF1a外顯子和內(nèi)含子模式圖的比較；(b)42Sp50和eEF1a基因組進(jìn)化分析，青鳉42Sp50和eEF1a分別位于15號(hào)染色體和11號(hào)染色體上，對(duì)應(yīng)于人類的6號(hào)染色體上。

對(duì)照eEF1a分子結(jié)構(gòu)進(jìn)化保守功能域的蛋白結(jié)合集團(tuán)，氨基?；Y(jié)合囊，以及核糖體結(jié)合部位(綠色下劃線)，發(fā)現(xiàn)青鳉eEF1a和42Sp50的氨基酸差異(星號(hào)*表示)，主要集中在GTP結(jié)合功能域(G1-G5)以外的部位(圖2)，在氨基酰基結(jié)合囊功能域和核糖體結(jié)合部位[17]，尤其在以核糖體結(jié)合部位有顯著差異。推測(cè)青鳉eEF1a和42Sp50可能各自選擇性結(jié)合并運(yùn)載特異氨基?；撂禺惖暮颂求w上，具有不同分工。

2.2 青鳉42Sp50在XX和XY型gsdf 敲除卵巢中的轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，42Sp50雖然在不同組織中有表達(dá)，但主要在卵巢中表達(dá)[圖3(a)]。腦和眼睛可檢測(cè)到微弱表達(dá)產(chǎn)物，雄性肝臟明顯高于雌性，而卵巢的表達(dá)顯著高于精巢。發(fā)現(xiàn)gsdf-/-XX卵巢和gsdf-/-XY卵巢中42Sp50的mRNA表達(dá)量呈顯著差異[圖3(b)]，提示42Sp50的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可能同卵細(xì)胞自身的XX和XY性染色體相關(guān)聯(lián)[圖3(b)]。

蛋白組學(xué)比對(duì)分析顯示，eEF1a蛋白產(chǎn)物在正常精巢和正常卵巢中無明顯差異，在gsdf-/-卵巢中略有上升[圖3(c)橙色Q9YIC0]。然而，正常卵巢的42Sp50蛋白表達(dá)量比正常精巢高250倍[圖3(c)]。

(a)42Sp50在正常青鳉各個(gè)組織中mRNA產(chǎn)物表達(dá)情況，主要在卵巢中表達(dá)，雄性精巢、肝臟、腦和眼也能檢測(cè)到；(b)42Sp50在gsdf-/- 卵巢中mRNA產(chǎn)物的表達(dá)情況；(c)蛋白組學(xué)結(jié)果顯示幾種關(guān)鍵因子在gsdf-/-卵巢中的變化。

2.3 eEF1a在性腺分化過程中的差異表達(dá)

(a)XX正常卵巢發(fā)育0 dah時(shí)eEF1a/H3k27me3的表達(dá)情況，白色箭頭指示進(jìn)入減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞；(b)和(b′)XY正常精巢發(fā)育0 d時(shí)eEF1a/H3k27me3的表達(dá)情況；(c)和(c′)gsdf-/-孵化5 d的卵巢(5dah)eEF1a/H3k27me3的表達(dá)情況，三角指示陽性生殖細(xì)胞，箭頭指示陰性生殖細(xì)胞；(d)和(e)XX正常卵巢和XY正常精巢發(fā)育1 mon時(shí) eEF1a/H3k27me3的表達(dá)情況；(f)和(f′)gsdf+/+卵巢發(fā)育1 mon時(shí)eEF1a/H3k27me3在I細(xì)胞和II細(xì)胞中的不同表達(dá)情況；(g)和(g′)gsdf-/-卵巢發(fā)育1-month時(shí) eEF1a/H3k27me3的表達(dá)情況。 eEF1a：紅色；h3k27me3：綠色；Dapi：藍(lán)色；G：生殖細(xì)胞； Sc：體細(xì)胞； I：I期卵母細(xì)胞； II：II期卵母細(xì)胞。圖4 eEF1a在XY性腺和XX性腺中的差異表達(dá)Figure 4 Differential expression of eEF1a between XX and XY gonad

在幼魚孵化時(shí)，正常XX雌性性腺中的生殖細(xì)胞數(shù)目已明顯多于XY雄性[圖4(a)和(b)]，有部分生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂偶線期[圖4(a)]。用抗人EEF1A的抗體幾乎檢測(cè)不到免疫熒光信號(hào)，而正常XY精巢生殖細(xì)胞數(shù)目要比雌性的少，卻有抗EEF1A的強(qiáng)信號(hào)[圖4(b)和(b′)]。從細(xì)胞核形狀上判斷，生殖細(xì)胞(G)和周圍的體細(xì)胞(Sc)中都能監(jiān)測(cè)到抗EEF1A信號(hào)[圖4(b)和(b′)]。孵化后5 d(5 dah)gsdf-/-XY卵巢中生殖細(xì)胞的數(shù)量明顯多于正常XY雄性和XX雌性[圖4(c)和(c′)]。生殖細(xì)胞和周圍體細(xì)胞都能檢測(cè)到抗EEF1A的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)陽性和陰性生殖細(xì)胞并存[圖4(c)和(c′)，三角和箭頭所示]。在1 month齡正常XX卵母細(xì)胞中檢測(cè)到微弱信號(hào)的抗EEF1A紅色信號(hào)[圖4(d)]，這種信號(hào)在正常XY精巢中的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞也能檢測(cè)到[圖4(e)]。研究發(fā)現(xiàn)1-month齡gsdf-/-XY卵巢中抗EEF1A信號(hào)較gsdf-/-XX型強(qiáng)[圖4(f)和(g)]，同mRNA轉(zhuǎn)錄相對(duì)定量分析的qPCR結(jié)果一致。gsdf-/-XX卵母細(xì)胞中有大量抗EEF1A(紅色)和抗H3k27me3(綠色)共表達(dá)蛋白顆粒，雙重信號(hào)疊加而呈黃色，這些蛋白顆粒在卵細(xì)胞發(fā)育中隨染色體動(dòng)態(tài)變化，由核內(nèi)向核周轉(zhuǎn)移至核膜[圖4(f′)]；在gsdf-/-XY卵細(xì)胞中沒有明顯的黃色顆粒，反映出EEF1A和H3k27me3共表達(dá)蛋白顆粒在XX型和XY型卵細(xì)胞中有明顯的量差[圖4(g)]。XY型初級(jí)卵母細(xì)胞中抗EEF1A紅色信號(hào)只在細(xì)胞質(zhì)中，同細(xì)胞核的抗H3K27me3綠色信號(hào)不重疊[圖4(g′)]。這些觀察結(jié)果顯示，eEF1a和H3k27me3的表達(dá)量和聚集分布在gsdf-/-XX和gsdf-/-XY初級(jí)卵母細(xì)胞中呈顯著差異。

3 討論與結(jié)論

在青鳉中發(fā)現(xiàn)了42Sp50在gsdf缺失XY型卵細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，顯著高于正常XX卵細(xì)胞[圖3(b)]。免疫熒光結(jié)果亦顯示在卵細(xì)胞發(fā)育過程中，H3K27me3和eEF1a蛋白的共表達(dá)在XX型和XY型之間有明顯差異[圖4(f′)和(g′)]。小鼠PGCs在胚胎性分化之前，要經(jīng)歷表觀遺傳的重編程過程，而H3K27me3和H3K4me2/3是體細(xì)胞/前驅(qū)細(xì)胞從休眠轉(zhuǎn)向活躍的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控因子，H3K27me3表達(dá)的減少或增加，受性染色體和X連鎖的體細(xì)胞/前驅(qū)因子等的調(diào)控[18]，這一機(jī)制可能在低等脊椎動(dòng)物的青鳉中也進(jìn)化保守存在。

在dmy體細(xì)胞性別決定因子啟動(dòng)性分化之前，青鳉XX和XY生殖細(xì)胞形態(tài)上相似，且具有兩性可塑性。常染色體foxl3基因在性分化啟動(dòng)前的II型生殖細(xì)胞中表達(dá)，具有抑制XX生殖細(xì)胞進(jìn)入雄性生精通路的功能系統(tǒng)[19]。本文發(fā)現(xiàn)H3K27me3和eEF1a蛋白在XX型和XY型卵細(xì)胞中的表達(dá)和分布，存在顯著差異，可能是性染色體上的dmy性別決定因子和常染色上的foxl3共同調(diào)控的結(jié)果。我們歸納整理了青鳉性腺雌雄性分化的分子信號(hào)通路(圖5)，在dmy-gsdf雄性信號(hào)通路被阻斷的XY生殖細(xì)胞中，H3K27me3無法正常完成對(duì)XY生殖細(xì)胞的核內(nèi)重編程，并可能在foxl3或未知雌性因子的作用下，使部分生殖細(xì)胞進(jìn)入雌性通路，形成XY型gsdf缺失卵巢中特有的雌雄生殖細(xì)胞并存的單囊簇[7]。gsdf雖不是雌雄配子發(fā)生的必需因子，但可能直接或間接地調(diào)控和影響著XX和XY生殖細(xì)胞進(jìn)入雌性或雄性分化的未知關(guān)鍵因子，影響eEF1a和42Sp50的表達(dá)量變化，以及H3K27me3蛋白顆粒的核內(nèi)至核膜的分布變化。這些變化是生殖細(xì)胞開啟雌性或雄性配子發(fā)生的原因還是結(jié)果，有待進(jìn)一步深入解析和確認(rèn)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)eEF1a蛋白表達(dá)量在正常成魚的精巢和卵巢中差別不大，在正常卵巢和gsdf缺失卵巢中也變化不明顯；但是42Sp50蛋白表達(dá)量呈顯著雌雄性別差異表達(dá)，雄性非常微弱，在正常雌性卵巢中高表達(dá)?？笻3K27me3和EEF1a雙色熒光免疫反應(yīng)顯示，正常XX和gsdf缺失的XY卵細(xì)胞有明顯差異。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究脊椎動(dòng)物雌雄配子發(fā)生和分化的分子機(jī)制，提供了新線索。