劉彥軍，姚四清，李毅

運(yùn)城市中心醫(yī)院胸外科，山西運(yùn)城044099

肺癌是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的主要原因［1］。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的病理類型，占肺癌總數(shù)的80%以上，其預(yù)后較差，5年生存率較低［2］。但目前NSCLC發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA，能夠通過(guò)與靶基因3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA功能異常是惡性腫瘤發(fā)生的重要因素。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。許多研究證實(shí)，miRNA能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為，參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展［3-5］。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)劑，通常在惡性腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，是惡性腫瘤表型和疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物［6-7］。XIA等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中miR-20b-5p異常表達(dá)，其異常表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控Cyclin D1和E2F轉(zhuǎn)錄因子1表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，提示miR-20b-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控Cyclin D1參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。但在NSCLC細(xì)胞中miR-20b-5p與Cyclin D1的關(guān)系尚不明確。2019年6月—2020年12月，本研究觀察了miR-20b-5p靶向調(diào)控Cyclin D1對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975、PC-9（以下稱A549、H1975、PC-9細(xì)胞）及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（以下稱BEAS-2B細(xì)胞），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。miR-20b-5p模擬物（miR-20b-5p mimic）及其陰性對(duì)照物（miR-NC）、Cyclin D1干擾質(zhì)粒（si-Cyclin D1）及其陰性對(duì)照質(zhì)粒（si-NC），由北京華大基因研究中心有限公司設(shè)計(jì)合成。所有引物序列由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。Cyclin D1基因相關(guān)的雙熒光素酶質(zhì)粒（野生型WT、突變型MT），購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。PTC-200型PCR儀，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司；Transwell小室，購(gòu)自美國(guó)Corning公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promega公 司；Prime ScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix EX Taq，購(gòu)自日本TaKaRa公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1、β-actin一抗及其相應(yīng)二抗，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 NSCLC細(xì) 胞 篩 選 A549、H1975、PC-9和BEAS-2B接種于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，按1∶4傳代。取傳4代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NSCLC細(xì)胞和人正常肺上皮細(xì)胞各2×105個(gè)，按總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按Prime ScriptTMRT Reagent Kit說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s。以cDNA為模板，按SYBR Premix EX Taq說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-20b-5p上游引物5′-UCGGGGU?CAAUCGCUUGCGU-3′，下游引物5′-GGUCGUGC?GUACUGGUUGCA-3′；U6上 游 引 物5′-UGCAU?CAUGCUCGUCAUGGCCGUAG-3′，下 游 引 物5′-UGCUAGCUGGCUAGCAACGUGCAC-3′。PCR擴(kuò)增體系共25μL：模板DNA 1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，ddH2O 17.25μL；反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量。選擇miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量最低的NSCLC細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR-20b-5p靶向調(diào)控Cyclin D1預(yù)測(cè)與驗(yàn)證借助Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR-20b-5p與Cyclin D1的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)野生型和突變型，以NSCLC細(xì)胞的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲取野生型和突變型序列，連接至野生型Cyclin D1 3′UTR（Cyclin D1 WT）和突變型Cyclin D1 3′UTR（Cyclin D1 MT）。將NSCLC細(xì)胞接種于12孔板，隨機(jī)分為Cyclin D1 WT組、Cyclin D1 WT+miR-20b-5p mimic組、Cyclin D1 MT組、Cyclin D1 MT+miR-20b-5p mimic組。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%左右時(shí)，Cyclin D1 WT組轉(zhuǎn)染Cyclin D1 WT，Cyclin D1 WT+miR-20b-5p mimic組轉(zhuǎn)染Cyclin D1 WT和miR-20b-5p mimic，Cyclin D1 MT組轉(zhuǎn)染Cyclin D1 MT，Cyclin D1 MT+miR-20b-5p mimic組轉(zhuǎn)染Cyclin D1 MT和miR-20b-5p mimic。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，按雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 取傳4代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NSCLC細(xì)胞，接種于6孔板，每孔4×105個(gè)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對(duì)照1組、miR-NC組、miR-20b-5p mimic組以及對(duì)照2組、si-NC組、si-Cyclin D1組，按Lipofeetamine2000說(shuō)明，miR-NC組與miR-20b-5p mimic組分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-20b-5p mimic質(zhì)粒，si-NC組與si-Cyclin D1組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-Cyclin D1質(zhì)粒，對(duì)照1組與對(duì)照2組不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，采用RT-qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法。收集上述miR-NC組與miR-20b-5p mimic組、si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，另設(shè)空白對(duì)照組（不加入細(xì)胞），置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4 h。棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，充分混勻，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值－空白對(duì)照組OD值）×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集上述miR-NC組與miR-20b-5p mimic組、si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清。每管加入Annexin V-FITC結(jié)合液500μL重懸，然后加入Annexin V-FITC 5μL、PI 10μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集上述miR-NC組與miR-20b-5p mimic組、si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室上室，下室加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500μL。然后將Transwell小室置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，輕輕拭去上室面未穿膜細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置相差顯微鏡下拍照觀察。隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取上述miR-NC組與miR-20b-5p mimic組、si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔密度接種于6孔板，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇固定24 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清。每管加入染色緩沖液500μL、20×PI 25μL、50×RNase 10μL重懸，37℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 Cyclin D1、CDK4、FOXM1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取上述miR-NC組與miR-20b-5p mimic組、si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，4℃下4 000 r/min離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量合格，加入等量loading buffer，100℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30μg，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。1%BSA室溫封閉2 h，分別加入Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1、β-actin一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室中曝光、顯影。Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC細(xì)胞與人正常肺上皮細(xì)胞miR-20b-5p表達(dá)比較 BEAS-2B、H1975、PC-9、A549細(xì)胞miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.12、0.48±0.11、0.46±0.11、0.32±0.08。H1975、PC-9、A549細(xì)胞mi R-20b-5p相對(duì)表達(dá)量均低于BEAS-2B細(xì)胞，并且A549細(xì)胞miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量低于H1975、PC-9細(xì)胞（P均<0.05）。因此，選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-20b-5p與Cyclin D1的靶向調(diào)控關(guān)系 經(jīng)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，miR-20b-5p與Cyclin D1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。Cyclin D1 WT組、Cyclin D1WT+mi R-20b-5p mimic組、Cyclin D1 MT組、Cyclin D1 MT+mi R-20b-5p mimic組熒光素酶活性分別為3.24±0.52、1.41±0.13、3.19±0.47、3.30±0.47，Cyclin D1WT+miR-20b-5p mimic組熒光素酶活性均低于其他三組（P均<0.05），而其他三組熒光素酶活性兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

圖1 mi R-20b-5p與Cyclin D1的靶向結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.3 各組轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)照1組、miR-NC組和miR-20b-5p mimic組miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為0.35±0.07、0.40±0.09、1.14±0.21，miR-20b-5p mimic組miR-20b-5p相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照1組和miR-NC組（P均<0.05），而對(duì)照1組與miR-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)照2組、si-NC組和si-Cyclin D1組Cyclin D1相對(duì)表達(dá)量分別為2.14±0.15、2.23±0.19、0.87±0.08，si-Cyclin D1組Cyclin D1相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照2組和si-NC組（P均<0.05），而對(duì)照2組與si-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞周期比較 見(jiàn)表1、2。

表1 mi R-NC組與miR-20b-5p mimic組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞周期比較（±s）

表1 mi R-NC組與miR-20b-5p mimic組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞周期比較（±s）

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

組別mi R-NC組mi R-20b-5p mimic組細(xì)胞存活率（%）97.6±2.6 53.6±4.2*細(xì)胞凋亡率（%）4.2±0.4 25.6±6.7*穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）35.1±3.5 12.6±2.7*細(xì)胞周期（%）G0期20.3±2.8 19.5±2.4 G1期58.4±6.2 74.2±7.2*G2/M期22.7±3.1 6.2±1.2*

表2 si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞周期比較（±s）

表2 si-NC組與si-Cyclin D1組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞周期比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P<0.05。

組別si-NC組si-Cyclin D1組細(xì)胞存活率（%）98.2±3.1 64.3±3.5*細(xì)胞凋亡率（%）4.5±0.7 23.7±5.2*穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）36.4±3.6 15.3±2.8*細(xì)胞周期（%）G0期20.6±2.6 21.0±2.4 G1期58.6±5.1 71.0±7.6*G2/M期23.5±3.3 7.6±1.8*

2.4 各組Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3、4。

表3 miR-NC組與miR-20b-5p mimic組Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 miR-NC組與miR-20b-5p mimic組Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

組別mi R-NC組mi R-20b-5p mimic組Cyclin D1 0.93±0.09 0.21±0.02*CDK4 0.85±0.07 0.25±0.03*FOXM1 0.96±0.10 0.95±0.13 p-FOXM1 0.89±0.08 0.42±0.07*

表4 si-NC組與si-Cyclin D1組Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 si-NC組與si-Cyclin D1組Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P<0.05。

組別si-NC組si-Cyclin D1組Cyclin D1 0.91±0.07 0.23±0.02*CDK4 0.89±0.07 0.21±0.03*FOXM1 0.94±0.12 0.95±0.11 p-FOXM1 0.83±0.05 0.20±0.02*

3 討論

據(jù)報(bào)道，2019年美國(guó)肺癌新發(fā)病例超過(guò)22萬(wàn)例，占所有新發(fā)惡性腫瘤的13%［9］。由于肺癌早期癥狀隱匿且缺乏特異性，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。有研究報(bào)道，早期肺癌患者5年生存率可達(dá)到70%，而晚期肺癌患者僅20%甚至更低［10］。目前，NSCLC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，進(jìn)一步研究NSCLC發(fā)病的分子機(jī)制，從而探索腫瘤早期診斷和靶向治療的生物標(biāo)志物具有重要意義。

miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。miR-20b-5p定位于人染色體Xq26.2，該區(qū)域與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［11］。miR-20b-5p在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等。目前，miR-20b-5p在NSCLC中的作用尚不明確。ARORA等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b-5p在NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)越低，患者5年生存率越低，提示miR-20b-5p在NSCLC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。ZHANG等［13］研究報(bào)道，與健康志愿者比較，NSCLC患者外周血中循環(huán)外泌體miR-20b-5p水平降低，并且miR-20b-5p可作為非侵入性早期診斷NSCLC的生物標(biāo)志物。PENG等［11］研究表明，miR-20b-5p在NSCLC組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，并能通過(guò)靶向B細(xì)胞易位基因3抑制NSCLC細(xì)胞增殖和遷移，有可能成為NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常肺上皮細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞miR-20b-5p表達(dá)降低，提示miR-20b-5p在NSCLC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。在H1975、PC-9、A549細(xì)胞中，A549細(xì)胞miR-20b-5p表達(dá)最低，故選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)A549細(xì)胞miR-20b-5p表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞遷移能力降低，G1期細(xì)胞比例增加、G2/M期細(xì)胞比例降低，進(jìn)一步證實(shí)mi R-20b-5p在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因作用，與以往報(bào)道［11-13］一致。

miR-20b-5p能夠通過(guò)MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等，參與細(xì)胞周期調(diào)控。Cyclin D1是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)劑。Cyclin D1能夠通過(guò)CDK4、CDK6的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，影響細(xì)胞周期從G1期到S期轉(zhuǎn)變?；钴S的Cyclin D1/CDK4復(fù)合物易位至細(xì)胞核，與細(xì)胞周期蛋白E/CDK2一起磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白，并消除對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖。Cyclin D1/CDK4/6復(fù)合物能夠使某些轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而激活或抑制細(xì)胞周期進(jìn)程所需基因的表達(dá)。Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移能力亦隨之降低。有研究報(bào)道，在轉(zhuǎn)基因小鼠中Cyclin D1通過(guò)CDK4/6依賴性機(jī)制驅(qū)動(dòng)甲狀旁腺瘤形成，而Cyclin D1過(guò)表達(dá)的甲狀旁腺細(xì)胞可能對(duì)CDK4/6抑制劑特別敏感，提示Cyclin D1過(guò)表達(dá)的晚期甲狀旁腺癌患者可接受CDK4/6抑制劑治療［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-20b-5p與Cyclin D1存在靶向調(diào)控關(guān)系；利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低A549細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞遷移能力降低，G1期細(xì)胞比例增加、G2/M期細(xì)胞比例降低。結(jié)果提示miR-20b-5p與Cyclin D1有可能成為NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)。

FOXM1參與細(xì)胞周期從G1期至S期的轉(zhuǎn)變，能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于衰老，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［15］。FOXM1在肝細(xì)胞癌、肺腺癌、胃癌等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。有研究報(bào)道，在黑色素瘤細(xì)胞中CCND1-CDK4/6復(fù)合物能夠促進(jìn)FOXM1磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展［16］。CDK4在對(duì)常規(guī)放療和化療有抵抗的惡性骨肉瘤中表達(dá)增加，并且其表達(dá)增加與患者高轉(zhuǎn)移率和預(yù)后不良有關(guān)［17］。本研究通過(guò)上調(diào)miR-20b-5p表達(dá)或敲低Cyclin D1表達(dá)，A549細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、p-FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，說(shuō)明miR-20b-5p靶向調(diào)控Cyclin D1的分子機(jī)制可能與Cyclin D1/CDK4/FOXM1信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，miR-20b-5p通過(guò)靶向調(diào)控Cyclin D1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲，抑制其凋亡并將細(xì)胞阻滯于G1期，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Cyclin D1/CDK4/FOXM1信號(hào)通路有關(guān)。