宋健 袁敏惠 劉爭(zhēng)輝 崔冰慧 褚宇鵬黃毓娟 惠建萍 沈舒文 于勇 孟凱強(qiáng)

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 712021)

胃癌前病變(PLGC)是指胃黏膜出現(xiàn)腸上皮化生、異形增生的病變，可惡變?yōu)槲赴赴┑乃劳雎饰痪尤虻谌籟1]，也是我國(guó)常見一種惡性腫瘤疾病。胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近年來更多的研究者認(rèn)為，胃癌的發(fā)生在于胃癌干細(xì)胞的存在和信號(hào)通路的異常表達(dá)，其中典型代表為Wnt/β-catenin信號(hào)通路，Lgr5作為Wnt/β-catenin通路的受體蛋白，也被大家認(rèn)為是眾多惡性腫瘤干細(xì)胞潛在的分子標(biāo)記物[2-6]。

本課題組在前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)之上，研究基于“毒瘀交阻”理論組方金果胃康膠囊對(duì)胃癌前病變大鼠模型Wnt/Lgr5信號(hào)通路調(diào)控的分子機(jī)制。

1 材料

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠90只,體重100～130 g，4～5周齡，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。

1.2藥物與試劑 N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)由日本東京化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)提供，編號(hào)：MO527；鹽酸雷尼替丁，貨號(hào)：S67363；4%的多聚甲醛溶液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，武漢博士德；RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒、熒光定量試劑盒，深圳艾偉迪；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；無水乙醇；二甲苯；Wnt1、β-catenin、Lgr5、β-actin，單克隆抗體，北京博奧森。金果胃康膠囊(產(chǎn)品批號(hào)：20190429)由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供；維酶素片(產(chǎn)品批號(hào)：20190104，國(guó)藥準(zhǔn)字H41024448)規(guī)格：0.2g×100片，由樂普恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3主要儀器 702超低溫冰箱，美國(guó)Thermo；TC-120 S+型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北泰維；B ETS-M5脫色搖床，江蘇Kylin-bell；5430R高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；全自動(dòng)高壓滅菌器，日本Sanyo；FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Protein Simple；CX21正置電子光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS；R 136型石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica；TK-218生物組織攤片機(jī)、烤片機(jī)，湖北泰維；C150酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotech；紫外分光光度計(jì)：Thermo公司，Nano Drop2000。

2 方法

2.1模型復(fù)制、分組及給藥 在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，把90只大鼠隨機(jī)抽取12只(空白組)，對(duì)于剩余78只大鼠進(jìn)行復(fù)制PLGC模型。空白組正常喂養(yǎng)，造模各組采用濃度為150 ug·mL-1的MNNG溶液自由飲用，結(jié)合饑飽失常、濃鹽水灌胃法[7]，直到17周末，病理切片確定造模成功，將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為5組?？瞻捉M及模型組大鼠每日生理鹽水灌胃；維酶素治療組大鼠按照0.068 g·mL-1濃度灌胃，金果胃康膠囊高、中、低劑量治療組大鼠分別按照0.096 g·mL-1、0.048 g·mL-1、0.024 g·mL-1濃度灌胃；以上灌胃均采用3 mL·只-1，每日1次。連續(xù)灌胃治療6周。

2.2取材 第23周末灌胃治療結(jié)束，禁食不禁水12h后處死，取大鼠胃小彎體-竇交界處黏膜組織。

2.3蛋白免疫印跡法檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)Wnt/Lgr5信號(hào)通路靶因子Wnt1、β-catenin、Lgr5表達(dá)水平。提取大鼠胃粘膜組織總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，10%的脫脂奶粉封閉1 h，滴加稀釋后的一抗，4℃左右慢搖過夜。用TBST室溫下?lián)u床上洗5 min×3次，加稀釋后的二抗，緩慢搖動(dòng)，室溫下孵育1h，之后用TBST洗5 min×3次，用圖像分析儀進(jìn)行曝光，ECL試劑顯影成像。PhotoShop整理去色，ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1一般情況 造模前各組大鼠在體重方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模成功后造模組大鼠與空白組大鼠體重方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 造模前后空白組與造模組體重比較

治療前與空白組相比，模型組及各藥物治療組大鼠體重下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療結(jié)束后與模型組相比，治療組大鼠體重均增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中空白組及中藥高、中劑量組、維酶素組大鼠體重增長(zhǎng)明顯。見表2。

表2 藥物干預(yù)前后各組大鼠體重比較

3.2大鼠胃黏膜病理改變情況

3.2.1HE染色和AB-PAS染色光鏡下觀察 模型組、各個(gè)治療組大鼠胃粘膜病理變化較空白組嚴(yán)重；治療組病理變化較模型組改善明顯，其中金果胃康膠囊中劑量治療組改善最為明顯。說明藥物干預(yù)后大鼠胃黏膜腸上皮化生的病變程度有所減輕，其中尤以金果胃康膠囊中劑量組效果最為顯著。

3.2.2免疫印跡法檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)Wnt/Lgr5信號(hào)通路靶因子Wnt1、β-catenin、Lgr5表達(dá)情況。

3.2.2.1蛋白顯影情況 應(yīng)用Western bloting法檢測(cè)Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白在各組織標(biāo)本中的表達(dá)。結(jié)果可見Wnt1、β-catenin、Lgr5條帶在模型組中的表達(dá)均增多，在各藥物治療組表達(dá)均有所減少。見圖1。

圖1 Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表達(dá)情況

3.2.2.2蛋白定量表達(dá)分析 與空白組相比，模型組Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表達(dá)量均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與模型組相比，中藥中、高劑量組、維酶素組Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表達(dá)量均顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定濃度的金果胃康膠囊可能通過降低Wnt1、β-catenin、Lgr5的蛋白及基因轉(zhuǎn)錄從而抑制了Wnt/Lgr5信號(hào)通路的表達(dá)，在一定程度上抑制胃腫瘤干細(xì)胞的過度增殖、遷徙、凋亡，從而起到預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)PLGC進(jìn)一步發(fā)展的作用。詳見表3，圖2，圖3，圖4。

表3 各組大鼠胃黏膜組織Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組大鼠胃黏膜組織Wnt1蛋白定量表達(dá)

圖3 各組大鼠胃黏膜組織β-catenin蛋白定量表達(dá)

圖4 各組大鼠胃黏膜組織Lgr5蛋白定量表達(dá)

4 討論

4.1胃腫瘤干細(xì)胞及Wnt/Lgr5信號(hào)通路與胃癌

Lgr5+是胃癌干細(xì)胞生物標(biāo)志物之一，正常情況下，Lgr5+細(xì)胞局限于胃竇腺體基底部[5,8]。在各種病理因素的作用下，導(dǎo)致干細(xì)胞最終轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤干細(xì)胞。Lgr5+胃癌干細(xì)胞的異常增多和侵襲遷移是腫瘤發(fā)生的早期事件，腫瘤干細(xì)胞和干細(xì)胞存在共同調(diào)節(jié)的信號(hào)通道(包括經(jīng)典Wnt，Notch，Sonic，hedgehog通道)，作為Wnt信號(hào)通路的靶基因，Lgr5+高表達(dá)參與胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[9-12]。

4.2“毒瘀交結(jié)”理論與金果胃康膠囊[13-19]我校沈舒文教授科研團(tuán)隊(duì)在長(zhǎng)期的臨床醫(yī)療實(shí)踐中，根據(jù)PLGC的中醫(yī)證候特征，創(chuàng)新性提出“毒瘀交阻胃絡(luò)”是胃癌前病變的核心病機(jī)。沈舒文教授認(rèn)為：胃癌前病變是在感染毒邪之后，出現(xiàn)氣滯、血瘀，進(jìn)而氣滯、毒結(jié)、血瘀三者互結(jié)，其“毒瘀交阻”損傷胃絡(luò)，致胃黏膜腺體萎縮，腸上皮化生或不典型增生，“毒瘀交阻”既是胃癌前病變的病理產(chǎn)物，又是胃癌發(fā)生的直接病因，毒可致瘀，瘀可致毒，兩者互為因果、相互加重病情，尤其是重度非典型增生及腸化階段以“毒瘀交阻”證為主，這一階段是發(fā)展成為胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然本病在臨床也可見到“氣陰兩虛、脾胃虧虛”正氣不足的一方面，但是更多的兼見有“氣滯、血瘀、毒壅、濕阻”邪氣實(shí)的一方面存在，而且正氣虛往往是因于“氣滯、血瘀、毒壅”邪氣實(shí)而致正氣虛。毒附于瘀而難于清解疏達(dá)，瘀附于毒而難于氣血疏通。因而我們?cè)谂R床治療過程中，始終應(yīng)以“毒瘀交阻”為最關(guān)鍵病機(jī)，扶正同時(shí)兼治毒瘀，給予解毒化瘀。解毒方法主要為清化濕熱，以清除Hp為主要目的；化瘀法當(dāng)消散胃絡(luò)凝瘀。

沈舒文教授基于中醫(yī)藥理論、立足臨床實(shí)踐結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)研究成果，研制出金果胃康膠囊，本方組成包括太子參、半枝蓮、枸橘、朱砂七，于2006年制成陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，通過前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)于“毒瘀交阻兼見氣陰兩虛”證型的胃癌前病變臨床治療效果顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)金果胃康膠囊可以改善PLGC大鼠的一般情況和胃黏膜的病理變化情況，同時(shí)還可以降低大鼠胃黏膜組織中Wnt1、β-catenin、Lgr5蛋白表達(dá)及基因轉(zhuǎn)錄水平。提示金果胃康膠囊可抑制胃癌干細(xì)胞Lgr5+分子標(biāo)志物過度表達(dá)，可能作用機(jī)制是通過抑制Wnt信號(hào)通路的活化，逆轉(zhuǎn)或延緩胃癌的發(fā)生、發(fā)展。