耿 茜，劉 洋，吳維青，張 瑚，謝建生

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心,廣東 深圳518028)

Noonan 綜合征(Noonan Syndrome,NS)是一種常染色體顯性遺傳病，活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率為1/1000-1/2500[1-2]，臨床主要以特殊面容、身材矮小、先天性心臟病等為特征，可累及多個(gè)系統(tǒng)。已明確的與NS相關(guān)的基因有：PTPN11，KRAS,SOS1,BRAF,RAF1,MAP2K1,NRAS,SHOC2,CBL[3-5]。由于Noonan 綜合征較高的臨床及遺傳異質(zhì)性，NS診斷、特別是產(chǎn)前診斷一直相對(duì)困難。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)NS產(chǎn)前的相關(guān)報(bào)道。我們追蹤1例孕早期發(fā)現(xiàn)頸部透明層(nuchal translucency,NT)增厚的胎兒，綜合分析其臨床各項(xiàng)檢查結(jié)果，應(yīng)用芯片捕獲高通量測(cè)序檢測(cè)出胎兒RAF1基因新發(fā)突變，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

孕婦，G1P0，27歲。否認(rèn)疾病家族史及近親結(jié)婚史。孕婦無(wú)放射性物質(zhì)接觸史，無(wú)藥物服用史。孕12周于深圳市婦幼保健院產(chǎn)檢B超示NT：6.7 mm。孕17周3天行羊水穿刺術(shù)，G顯帶染色體核型分析及染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)均未見(jiàn)異常。孕23周Ⅲ級(jí)超聲檢查示：?jiǎn)翁?，胎兒頭位；胎頭雙頂徑長(zhǎng) 5.5 cm，頭圍19.73 cm，腹圍19.36 cm；胎兒多發(fā)畸形：頸部水囊瘤，小下頜，前額軟組織增厚，雙腎盂輕度分離，足跟聲像改變。孕27周B超示：頸部水囊瘤較前次縮小，下頜小，雙腎盂輕度分離，足跟聲像改變。后顱窩池寬約1.09 cm。心室壁增厚，舒張期右室前壁厚約0.49 cm，上、下腔靜脈擴(kuò)張，見(jiàn)圖1。

圖1 胎兒超聲檢測(cè)異常圖像

1.2 研究方法

1.2.1全基因組DNA提取 孕婦羊水標(biāo)本及夫妻雙方外周血標(biāo)本應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen，Hilden，Germany)。

1.2.2芯片捕獲高通量測(cè)序 應(yīng)用定制的基因片段捕獲探針(Roche NimbleGen，Madison,USA)，主要針對(duì)NS相關(guān)的MAP2K1、PTPN11、KRAS、SOS1、RAF1、BRAF、NRAS基因。實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程經(jīng)DNA打斷、末端補(bǔ)平、加接頭后完成建庫(kù)，隨后進(jìn)行探針捕獲及LM-PCR反應(yīng)，文庫(kù)經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和 BMG進(jìn)行片段大小、濃度檢測(cè)，合格后將需要不同數(shù)據(jù)量的文庫(kù)進(jìn)行pooling、定量，經(jīng)環(huán)化后的文庫(kù)經(jīng)過(guò)make DNB后利用高通量測(cè)序儀BGISEQ-500連續(xù)雙向測(cè)序50個(gè)循環(huán)，并讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，并應(yīng)用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)、GATK軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI dbSNP,HapMap,1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)進(jìn)行比對(duì),采用致病性預(yù)測(cè)軟件(SIFT,Polyphen2,MetaSVM,PROVEAN,M-CAP等)篩選可疑突變，根據(jù)ACMG指南對(duì)變異進(jìn)行分類。

1.2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)于可疑突變，在其所在片段上下游設(shè)計(jì)引物。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物做Sanger測(cè)序，所得結(jié)果與RAF1基因標(biāo)準(zhǔn)序列NM_002880進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證基因芯片捕獲和高通量測(cè)序的結(jié)果。并對(duì)雙親進(jìn)行家系驗(yàn)證以明確其遺傳方式。

2 結(jié)果

基因檢測(cè)結(jié)果顯示，患兒RAF1基因存在雜合的錯(cuò)義突變C.1082 G>C,p.Gly361Ala。Sanger測(cè)序驗(yàn)證家系成員，發(fā)現(xiàn)其父母此位點(diǎn)為正?；蛐?，該變異為“新發(fā)突變(De novo)”，見(jiàn)圖2。

該變異在參考人群數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有報(bào)道，多項(xiàng)軟件預(yù)測(cè)有害，已有文獻(xiàn)[6]報(bào)導(dǎo)在Noonan綜合征患者中發(fā)現(xiàn)該突變，根據(jù)ACMG變異分類指南，該變異為致病性變異。結(jié)合文獻(xiàn)及其臨床資料，充分告知遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)后孕婦選擇終止妊娠。

圖2 胎兒及其父母RAF1基因測(cè)序圖

3 討論

NT增厚是妊娠早期常見(jiàn)的超聲軟指標(biāo)異常，其中約20%的胎兒可檢出染色體異常[7]。且NT值越高，染色體異常的可能性越大，Snijders等[8]研究發(fā)現(xiàn)，NT≥6.5 mm時(shí)染色體異常的發(fā)生率為64.45%。本例胎兒孕12周NT值為6.7 mm，但染色體和CMA結(jié)果正常。此類NT增高的胎兒仍然是各種先天畸形和遺傳綜合征的高危群體，這些胎兒的父母常處于焦慮和兩難的境地，需要遺傳咨詢和進(jìn)一步的檢查來(lái)明確診斷。Noonan綜合征是已知與NT增厚最為相關(guān)的單基因遺傳病[9]。Houweling AC等[10]在2013年嘗試對(duì)NT增厚且染色體核型分析正常的75例胎兒，針對(duì)NS相關(guān)的PTPN11、KRAS、SOSl和RAF1基因進(jìn)行平行測(cè)序，致病突變檢出率為17.3%。

Noonan 綜合征與編碼RAS-MAPK通路的基因突變相關(guān)，已鑒定的有PTPN11，KRAS,SOS1,BRAF,RAF1,MAP2K1,NRAS,SHOC2,CBL。約50%的NS患者可檢出PTPN11基因致病性突變[11-12]，RAS-MAPK通路在調(diào)控細(xì)胞周期、分化、生長(zhǎng)及衰老等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，編碼這一通路的基因若在生殖細(xì)胞發(fā)生致病突變，相應(yīng)通路的失調(diào)則會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的發(fā)育障礙。NS的臨床特征主要有特殊面容、身材矮小、先天性心臟病、骨骼異常、隱睪癥及不同程度的發(fā)育障礙。不同基因突變所引發(fā)的臨床表型不盡相同。

NS相關(guān)基因在人類基因組中的跨度達(dá)30 Kb,經(jīng)典的Sanger測(cè)序技術(shù)診斷NS需多步驟處理，綜合考慮相關(guān)基因突變的檢出頻率及其對(duì)應(yīng)的特征性臨床表型，PTPN11基因通常作為Sanger測(cè)序的首選基因，其次是其他RAS / MAPK途徑的其它相關(guān)基因，依次如SOS1，RAF1和KRAS[13-14]，這種檢測(cè)方案非常費(fèi)時(shí)并且昂貴。高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，為Noonan綜合征提供了更加高效和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方案[15]。

本例胎兒應(yīng)用針對(duì)NS相關(guān)基因的靶向二代測(cè)序技術(shù)，檢出了RAF1基因的新發(fā)突變C.1082 G>C,p.Gly361Ala。該突變?cè)趨⒖既巳簲?shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有報(bào)道，多項(xiàng)軟件功能預(yù)測(cè)有害。2007年P(guān)andit等[5]首次報(bào)道了RAF1基因突變導(dǎo)致的Noonan綜合征病例。RAF1基因編碼的蛋白有三個(gè)保守區(qū)域：CR1,CR2和CR3。已知的RAF1致病突變大都集中在CR2區(qū)、CR3的激酶活化區(qū)域和C-末端[16]。本例突變位于保守區(qū)域CR3，但不在突變熱點(diǎn)激酶活化區(qū)內(nèi)。已知的NS相關(guān)RAF1致病突變通常直接或間接的引發(fā)MEK-ERK相關(guān)通路的過(guò)度活化，這一過(guò)程可通過(guò)增強(qiáng)RAF1激酶活性和/或通過(guò)增加與RAF1同源二聚體或單體相比催化活性更強(qiáng)的RAF1-BRAF異二聚體來(lái)實(shí)現(xiàn)[17-18]。Antony等人[19]發(fā)現(xiàn)p.Gly361Ala突變會(huì)使RAF1對(duì)RAF和MEK抑制因子產(chǎn)生拮抗作用。與野生型RAF1的細(xì)胞異位表達(dá)相比，RAF1Gly361Ala突變體在HEK 293/T細(xì)胞中的短暫表達(dá)會(huì)引起MEK和ERK磷酸化增加，繼而導(dǎo)致MEK-ERK信號(hào)通路活化增強(qiáng)。 2017年Frederike L.等[6]報(bào)道了兩例RAF1基因C.1082 G>C,p.Gly361Ala突變的患兒，患兒都具有NS典型的容貌特征，身材矮小及肺動(dòng)脈狹窄，其中一例出現(xiàn)了肥厚型心肌病。依據(jù)ACMG變異分類指南，該變異為致病變異。

本例胎兒B超亦發(fā)現(xiàn)心室壁增厚，NS致病基因中，RAF1基因突變與肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)的發(fā)生發(fā)展最為密切相關(guān)，RAF1基因突變的NS患者約73-83%伴有HCM，且有早發(fā)HCM的可能性[20-21]。早發(fā)的HCM，有些迅速進(jìn)展為充血性心力衰竭，預(yù)后極差。故早期做出準(zhǔn)確診斷尤為重要[22]。

國(guó)外研究報(bào)道過(guò)的NS胎兒期的主要臨床指征包括NT增厚、頸靜脈淋巴囊(jugular lymphatic sacs,JLS)擴(kuò)張、頸部水囊瘤、胎兒水腫、胸膜積液、羊水過(guò)多、先心、腎臟發(fā)育異常等[23]。本例胎兒出現(xiàn)了NT增高、頸部水囊瘤、心室壁增厚、雙腎盂輕度分離，并伴有小下頜、足跟聲像改變等，為本次基因診斷提供了依據(jù)，也為NS基因型-表型分析、NS產(chǎn)前篩查和基因診斷積累了臨床資料。

由于Noonan綜合征臨床表型的多樣化及其遺傳異質(zhì)性，NS診斷，特別是產(chǎn)前診斷一直極具挑戰(zhàn)性。二代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展為這一課題提供了進(jìn)一步的遺傳學(xué)解讀方案。本例對(duì)NS產(chǎn)前診斷的初步研究證實(shí)了其臨床可行性，但其臨床納入指征的選擇和系統(tǒng)化實(shí)驗(yàn)室診斷體系的建立仍然需要不斷的數(shù)據(jù)積累和臨床實(shí)踐。