姜洪波,孫利偉*,田玉玲,杜 娟,劉宇奇,王利武,馬英偉

(1.長春市兒童醫(yī)院 精準(zhǔn)兒童醫(yī)學(xué)中心,吉林 長春130061；2.吉林省醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130021)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD) 已成為關(guān)系全球人類健康的重要疾病之一，全球發(fā)病率約為8%-16%[1]。CKD最終的歸宿是腎功能衰竭。腎衰的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究腎衰的發(fā)病機(jī)制，一直是臨床急需解決的問題。本研究應(yīng)用阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶，給大鼠靜脈注射或/和肌肉注射，成功建立了大鼠慢性腎功能衰竭動(dòng)物模型,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)SD大鼠，6-8周齡，雄性，體重300 g左右，18只，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。18只動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)和模型B組、C組、D組、E組、F組，共計(jì)6組，每組3只大鼠。

1.2 主要儀器設(shè)備電子分析天平(Precisa12A)，為瑞士產(chǎn)品；蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，保定蘭格恒流泵有限公司；顯微外科手術(shù)器械包(SSW-3型)，上海手術(shù)器械廠；純水儀，德國Millipore產(chǎn)品。

1.3 主要試劑(1)PBS磷酸鹽緩沖液。(2)7%水合氯醛，室溫避光保存。(3)4%多聚甲醛。(4)5 mg/ml鹽酸阿霉素：鹽酸阿霉素25 mg，溶于5 ml生理鹽水中。(5)20 mg/ml頭孢噻啶：頭孢噻啶100 mg，溶于5 ml生理鹽水中。(6)尿蛋白定量測(cè)定試劑盒，肌酐測(cè)定試劑盒，尿素氮測(cè)定試劑盒，血清鉀、鈣、磷檢測(cè)試劑盒，均為南京建成產(chǎn)品。(7)HE染色固定液。(8)阿霉素為meilunbio產(chǎn)品(產(chǎn)品編號(hào)：MB1087)、頭孢噻啶購自酷爾化學(xué)科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng) 動(dòng)物房12 h-12 h晝夜交替，保持動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，溫度23-25℃，飼養(yǎng)在代謝籠中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.4.2動(dòng)物建模 實(shí)驗(yàn)鼠稱重并麻醉， B、D、E、F組分別按照6.5 mg/kg的劑量給與阿霉素尾靜脈注射1次，第2天C、D、E、F組分別按照60 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg的量于后肢大腿外側(cè)肌肉注射頭孢噻啶，連續(xù)注射3天。A組大鼠給予5ml生理鹽水尾靜脈注射3天。

1.4.3實(shí)驗(yàn)取材 ?尿液取材 將大鼠飼養(yǎng)在代謝籠里，正常提供水和飼料，在完成3天肌注后第3天、7天、14天，收集每只大鼠24 h尿液，用于生化檢測(cè)。?血清取材 在肌注后第14天尾靜脈取血、28天各組大鼠稱重并麻醉，分別取眼眶血和剪開腹腔暴露腹主動(dòng)脈，用止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈近心端將采血針插入腹主動(dòng)脈，松開止血鉗將采血管插在采血針另外一頭取血。血液靜置1-2 h后離心(3 000轉(zhuǎn)/min，20 min，4℃)，取上層血清用于生化檢測(cè)。?腎臟取材 在肌注后第28天各組大鼠稱重并麻醉，剪開胸廓暴露心臟，將灌注泵一端針頭插入左心室中，并用止血鉗固定，剪開右心耳，開放靜脈血。首先灌注100 ml-200 ml生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛200 ml-300 ml固定。灌注后的大鼠將腹腔剪開取出腎臟放于4%多聚甲醛中固定用于HE檢測(cè)。

1.4.4尿蛋白含量測(cè)定 尿液標(biāo)本應(yīng)用尿蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行尿蛋白檢測(cè)，方法嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1.4.5血清肌酐、尿素氮、血清鉀、鈣、磷含量檢測(cè) 將采集的血液標(biāo)本，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮、血清鉀、鈣、磷含量。檢測(cè)方法按試劑說明書進(jìn)行。

1.4.6腎臟病理 分別取A、B、C、D、E、F組大鼠的腎臟組織，進(jìn)行組織石蠟包埋、石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管間質(zhì)病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0 軟件。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿量及尿蛋白含量變化

2.1.1尿量比較 模型B、C、D、E、F組與正常對(duì)照A組比較，用藥后第7天和14天尿量均明顯增多，經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(F7天=8.442，P7天=0.001；F14天=47.758，P14天=0.000)。B、C組與D、E、F組比較，在用藥后第3天尿量無明顯差異；第7天F組尿量較B組(P=0.029)和C組(P=0.014)明顯增多，見圖1。

圖1 大鼠尿量比較

2.1.2尿蛋白量比較 模型B、C、D、E、F組與正常對(duì)照A組比較，在用藥后第3天、7天、14天尿蛋白量均明顯增高；D、E、F組尿蛋白量均值依次增高；經(jīng)方差分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 用藥后大鼠尿蛋白量均值(mg/L)的變化

比較各模型組大鼠結(jié)束用藥后3天、7天、14天尿蛋白量，隨著用藥時(shí)間增多，尿蛋白量也明顯增多， B、C組與D、E、F組比較，用藥后3天，F(xiàn)組較B組， D、E、F組較C組尿蛋白量增多；用藥7天、14天D、E、F組與B、C組尿蛋白量比較均明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠用藥后血清肌酐、尿素氮變化在用藥后第14天和28天取血樣檢測(cè)血清肌酐和尿素氮，模型B、C、D、E、F組大鼠血清肌酐和尿素氮均值均明顯升高，與正常對(duì)照A組比較，存在明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。聯(lián)合用藥的D、E、F組與不聯(lián)合用藥的B、C組分別比較，血清肌酐和尿素氮均值亦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 用藥后大鼠血清肌酐(μmol/L)、尿素氮(mmol/L)均值

2.3 各組大鼠用藥后血鉀、鈣、磷含量變化用藥后第14天、28天模型B、C、D、E、F組大鼠血鉀、血磷增高，血鈣降低；聯(lián)合用藥D、E、F組與單獨(dú)用藥的B組、C組分別比較，用藥后第14天血鉀、血磷增高，血鈣降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用藥后第28天血鉀、血磷增高，血鈣降低，除血鈣B組與D組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P血鈣=0.106)外，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組大鼠腎臟病理改變正常對(duì)照組腎形態(tài)正常，腎結(jié)構(gòu)比較清晰，腎小球比較規(guī)則(圖2)；與正常對(duì)照組比較，B組(阿霉素6.5 mg/kg組)(圖3)、C組(頭孢噻啶60 mg/kg組)(圖4)腎小球系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚；阿霉素與頭孢噻啶聯(lián)合作用的D、E、F組的部分腎小球出現(xiàn)分葉狀，腎小囊內(nèi)血漿蛋白滲出，隨著頭孢噻啶濃度的增加，病變病理改變更加明顯，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)損傷，上皮細(xì)胞空泡變性和纖維化；毛細(xì)血管袢分辨不清，見圖5、6、7。

3 討論

我國慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率持續(xù)上升[2],明確發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)，進(jìn)行早期診斷和治療有重要的意義。CKD表現(xiàn)為進(jìn)行性和不可逆腎單位特征喪失，腎再生能力降低、微血管損傷、代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎組織纖維化[3]。CKD的原因及發(fā)病機(jī)制多且復(fù)雜；臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，主要表現(xiàn)為代謝紊亂，早期癥狀不明顯，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，病情已經(jīng)進(jìn)展，健康的腎單位已經(jīng)明顯減少，進(jìn)展到衰竭期和尿毒癥期。治療以腎臟透析為主，或進(jìn)行腎移植。CKD的進(jìn)展與急性腎損傷(AKI)和反復(fù)發(fā)作AKI有關(guān)(稱為AKI到CKD轉(zhuǎn)換)。同樣，AKI可以導(dǎo)致CKD的發(fā)展[4]。

表3 用藥后大鼠血清鉀、鈣、磷含量

圖2 A組HE染色腎臟常規(guī)病理 圖3 B組HE染色腎臟病理改變

圖4 C組HE染色腎臟病理改變 圖5 D組HE染色腎臟病理改變

阿霉素為蒽環(huán)類抗生素，是細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物。是經(jīng)典的嚙齒類動(dòng)物腎臟損傷的誘發(fā)劑， 能夠引發(fā)初期腎小球局灶節(jié)段性硬化癥， 能夠很好地模擬人體慢性腎臟損傷過程。1970 年，Sternberg 首次報(bào)道蒽環(huán)類抗生素能夠引起腎炎[5]。阿霉素可損害腎近曲小管上皮細(xì)胞，使其脫離，并與管腔內(nèi)的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分融合成管型，堵塞管腔，使腎內(nèi)壓增高，產(chǎn)生損傷[6]。阿霉素腎炎動(dòng)物模型的典型特征是用藥幾天之內(nèi)就發(fā)生腎臟的嚴(yán)重?fù)p傷， 但損傷發(fā)生的時(shí)段很穩(wěn)定，且可以預(yù)料，因此動(dòng)物造模過程中死亡率較低(5%)[7]，造模相對(duì)簡單，成功率高。

圖6 E組HE染色腎臟病理改變 圖7 F組HE染色腎臟病理改變

頭孢噻啶為頭孢菌素類抗菌藥物，具有腎毒性，可引起腎損害，正常治療劑量尿中即有透明管型出現(xiàn)。每日8 g以上，常會(huì)造成腎小管壞死，表現(xiàn)為蛋白尿、管型尿和血尿、尿素氮升高等，甚至出現(xiàn)少尿或急性腎功能衰竭[8]。早在1966年，Atkinson就成功建立了頭孢菌素腎毒性動(dòng)物模型[9]。但是，阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶制備大鼠慢性腎衰竭的動(dòng)物模型，目前未見報(bào)道。頭孢菌素類抗生素在臨床被廣泛應(yīng)用，與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用亦較常見；國內(nèi)外均有相關(guān)副作用的報(bào)道[10-12]。

本研究成功制備了阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶致大鼠慢性腎衰竭的模型，并與單獨(dú)應(yīng)用阿霉素和頭孢噻啶藥物建立的大鼠慢性腎衰竭模型進(jìn)行比較。模型組與對(duì)照組大鼠比較，在造模過程中尿量、尿蛋白量明顯增多；肌酐和尿素氮明顯增多；血鉀和血磷明顯增高；血鈣降低；均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組比較，在造模過程中代謝紊亂更加明顯，表現(xiàn)為尿量增多、尿蛋白升高，血肌酐、尿素氮、血鉀、血磷升高，血鈣降低。慢性腎功能衰竭病理演化過程是多種因素引起腎小球和腎小管的損傷，持續(xù)損傷造成腎組織萎縮、纖維化[13]。本研究模型組腎小球出現(xiàn)不同程度萎縮硬化的表現(xiàn)。聯(lián)合用藥組出現(xiàn)明顯的腎小管病變，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)損傷，上皮細(xì)胞空泡變性和纖維化；毛細(xì)血管袢分辨不清等病理損傷。

本研究建立的阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶大鼠CKD模型。阿霉素用藥量較少，避免了對(duì)心臟等重要臟器的損傷作用而導(dǎo)致動(dòng)物早期死亡，實(shí)驗(yàn)失敗情況的發(fā)生。阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶大鼠CKD模型，造模方法簡單，腎臟病理損傷明顯，接近慢性腎衰的臨床實(shí)際。是研究慢性腎功能衰竭發(fā)生機(jī)制、病理損害及藥物干預(yù)等的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。