張 鴻，李 偉，王 輝，侯 峰，劉 斐，史孟杰

(陜西省人民醫(yī)院 血管外科，陜西 西安710068)

神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP1)是神經(jīng)纖毛蛋白家族中的一種跨膜非酪氨酸激酶蛋白，在血管生成、神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[1-2]。NRP1在惡性腫瘤的表達(dá)可通過觸發(fā)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其他途徑促進(jìn)腫瘤增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[3]。近期的研究證實(shí)NRP1信號(hào)介導(dǎo)的Treg在腫瘤內(nèi)的蓄積可能在加劇荷瘤小鼠缺血性腦損傷中起關(guān)鍵作用，并且可能作為癌癥和中風(fēng)合并癥的免疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)[4]。提示NRP1可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞從而影響腫瘤細(xì)胞的增值轉(zhuǎn)移。在胃癌中，NRP1的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展的發(fā)展密切相關(guān)，并與總生存率較差相關(guān)[5]。在胃癌中，腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)同樣發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)研究表明，胃癌T細(xì)胞亞群密度高與患者生存延長(zhǎng)有關(guān)[6]。此外，人們認(rèn)為自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是胃癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)[7]。本研究通過生物信息學(xué)分析，擬證實(shí)NRP1基因通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)來影響胃癌的預(yù)后。為胃癌的免疫治療提供更多的治療靶點(diǎn)。

1 生物信息分析方法

1.1 TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)數(shù)據(jù)庫(kù)

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型的免疫浸潤(rùn)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[8]?？梢酝ㄟ^在所有TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤中使用Diff Exp模塊來區(qū)分腫瘤與鄰近正常組織之間靶基因的差異表達(dá)。本研究中，我們TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析了NRP1在泛癌中的表達(dá)，同時(shí)通過腫瘤免疫估計(jì)分析了胃癌患者中6種類型的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的豐富度，分析了NRP1表達(dá)及其相關(guān)性。并且使用Wilcoxon檢驗(yàn)評(píng)估NRP1表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，多因素分析NRP1表達(dá)、腫瘤純度以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)患者預(yù)后的影響，P值<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[9](https://www.kmplot.com) 用于分析有關(guān)基因表達(dá)與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系。本研究分析了NRP1基因 mRNA 表達(dá)水平對(duì)胃癌患者的至第一次進(jìn)展時(shí)間(FP)和總生存期(OS)的影響，將患者樣本按最佳分界值(高表達(dá)與低表達(dá))分為兩組，并繪制生存曲線，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中 NRP1 基因 mRNA 差異表達(dá)及預(yù)后

本研究使用 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)比較了不同類型惡性腫瘤和配對(duì)的正常組織中 NRP1 的轉(zhuǎn)錄水平。分析顯示，NRP1 在胃癌正常及腫瘤組織中均表達(dá)，且胃癌腫瘤組織 vs 正常組織表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖 1。

另外，基于Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)我們進(jìn)一步證實(shí)，NRP1 基因高表達(dá)的胃癌患者擁有較差的至第一次復(fù)發(fā)時(shí)間(24.3月對(duì)比49.5月，P=0.0059)，同樣的，NRP1高表達(dá)預(yù)示患者總生存期較差(34.7月對(duì)比70.4月，P=0.0036)，見圖2。

2.2 NRP1表達(dá)與6種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

通過分析NRP1表達(dá)與6種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NRP1表達(dá)與胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，其中與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.173,P=7.21e-04)，其表達(dá)與胃癌微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性類細(xì)胞呈正相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是，與B細(xì)胞浸潤(rùn)無關(guān)(r=-0.124,P=1.74e-02)。該研究證實(shí)NRP1與胃癌免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)存在相關(guān)性，見圖3。

2.3 NRP1的SCNA(Somatic Copy Number Alterations)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

免疫監(jiān)視在確定各種類型癌癥的預(yù)后中的重要性已被廣泛接受。為了進(jìn)一步檢查NRP1的基因組指標(biāo)與胃癌中免疫浸潤(rùn)程度之間的相關(guān)性，通過GISTIC 2.0定義了SCNA。在這項(xiàng)基因組數(shù)據(jù)研究中，具有NRP1基因SCNA的胃癌被分為5個(gè)級(jí)別，包括深度缺失、臂級(jí)缺失、正常、臂級(jí)獲得和高擴(kuò)增。我們?cè)u(píng)估了所有胃癌的SCNA 6種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，包括B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。結(jié)果表明，NRP1的SCNA的臂級(jí)獲得與6種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)均相關(guān)(P<0.05)，見圖4。

圖1 TIMER分析各種類型的惡性腫瘤組織和正常組織中NRP1的表達(dá)

圖2 胃癌中NRP1表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響

圖3 胃癌中NRP1基因表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性

2.4 NRP1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響

TIMER中的多因素生存分析顯示(圖5)，在胃癌中，NRP1表達(dá)是影響其預(yù)后的獨(dú)立的影響因素(HR:1.43,95%置信區(qū)間：1.13-1.82，P=0.003)。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)同樣影響胃癌患者的預(yù)后(HR:76.53,95%置信區(qū)間：3.43-1705.40，P=0.004)。

3 討論

NRP1參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和癌癥的發(fā)病機(jī)制，在血管生成中同樣發(fā)揮重要作用。研究表明，NRP1在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)。NRP1可以通過誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)來參與腫瘤的發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10-11]。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，對(duì)NRP1表達(dá)水平的分析可以為胃癌患者的預(yù)后提供預(yù)測(cè)指標(biāo)[5]。此外，NRP1也是癌癥治療的令人期待的潛在治療靶點(diǎn)[12]。本文通過生物信息學(xué)分析，證實(shí)NRP1在胃癌中特異性高表達(dá)，且其為胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立影響因子，提示其可作為胃癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

圖4 胃癌中NRP1基因SCNA類型與免疫細(xì)胞哦浸潤(rùn)之間的關(guān)系

圖5 免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響

關(guān)于NRP1表達(dá)與胃癌患者臨床患者預(yù)后之間的關(guān)系目前尚無定論。多項(xiàng)研究檢測(cè)了NRP1蛋白在胃癌中的表達(dá)，分析了NRP1蛋白異常表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。楊等人的研究[13]證明NRP1表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，有些研究卻得出相反的結(jié)論[14]。一項(xiàng)研究證實(shí)，高表達(dá)NRP1和PDGFRB的胃癌患者比其他患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加近兩倍[5]。一項(xiàng)薈萃分析來評(píng)價(jià)NRP1蛋白的表達(dá)與胃癌的臨床病理特征之間的相關(guān)性，此研究共納入12項(xiàng)研究，包括1225名胃癌患者。結(jié)果表明，腫瘤大于5 cm的胃癌NRP1蛋白表達(dá)陽性率高于腫瘤小于5 cm的胃癌，Ⅲ-Ⅳ期高于Ⅰ-Ⅱ期，低分化高于良好/中度分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)論與上述研究相似，即NRP1高表達(dá)是胃癌預(yù)后不佳的預(yù)測(cè)因子。

本研究證實(shí)，NRP1表達(dá)與胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，其中與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。與B細(xì)胞浸潤(rùn)無關(guān)。提示NRP1與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)存在相關(guān)性，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞可通過直接或間接參與免疫應(yīng)答和血管生成影響腫瘤患者的預(yù)后。例如，樹突狀細(xì)胞可以捕獲和呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞釋放的抗原；CD8+T細(xì)胞可以溶解和吞噬腫瘤細(xì)胞[16-18]。上述研究提示實(shí)體腫瘤與腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，可顯著影響治療療效和整體生存率。

巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與惡性腫瘤之間的相關(guān)性是目前研究的熱點(diǎn)問題。眾所周知，巨噬細(xì)胞是一種多用途的細(xì)胞，在不同的趨化因子刺激下，可以極化為促炎巨噬細(xì)胞M1和免疫抑制巨噬細(xì)胞M2[19]。 其中M1和M2均參與腫瘤進(jìn)展過程，但M1通過激活毒性中間體和活性氧中間體的產(chǎn)生，主要起保護(hù)因素，而M2則是其促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素[20-21]。巨噬細(xì)胞M0具有與M1相似但稍弱的功能。一項(xiàng)旨在探索免疫微環(huán)境免疫浸潤(rùn)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性的研究并未得出理想的結(jié)果，巨噬細(xì)胞與胃癌患者病理分期有關(guān)，但是與胃癌患者的總生存期無關(guān)[22]。在本研究中，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與胃癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合前面的結(jié)果，NRP1表達(dá)與巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，提示，NRP1可能與巨噬細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致胃癌進(jìn)展。具體的結(jié)論尚需后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)分析證實(shí)，NRP1可作為胃癌患者的一個(gè)重要的臨床生物標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)提供了全面的證據(jù)。NRP1轉(zhuǎn)錄水平與胃癌的生存結(jié)局和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。NRP1可能在腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用，并可作為胃癌的預(yù)后生物標(biāo)志物加以應(yīng)用。