周 洋,陳芳芳,王桂蘭,齊曦明,康厚鑫,吳小波*

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 兒科,河北 秦皇島066000；2.秦皇島市第一醫(yī)院 中心實驗室,河北 秦皇島066000;3.河北北方學院 兒科學,河北 秦皇島066000)

Epstein-Barr病毒，簡稱EB病毒(EBV)，是目前兒科臨床最常見的感染性疾病之一[1-2]。主要通過唾液傳播(親吻病)，也可通過輸血、器官移植等進行傳播。兒童中非腫瘤性EBV感染疾病主要包括傳染性單核細胞增多(Infectious mononucleosis,IM)、慢性活動性EBV感染(Chronic active EBV infection,CAEBV)、EBV相關噬血淋巴組織細胞增生癥(EBV associated hemophagocytosis,EBV-HLH)，后兩種疾病是較為嚴重的EBV感染相關疾病[3-4]。其預后不良，病死率高。必須要引起兒科醫(yī)師高度重視，來進行臨床和實驗研究[5-6]。但是，目前我國兒童EBV的流行病學、并發(fā)癥、臨床和實驗室檢查特征、機體對EB病毒的細胞免疫和體液免疫特點等缺乏系統(tǒng)性研究，而且對EBV相關疾病及重癥EB病毒感染的實驗室診斷、免疫學研究及相關治療報道較少。Th17、Treg細胞是近年免疫學研究的熱點[7]。有研究表明，其平衡機制及其相關因子(IL-17、TGF-β)的變化，在機體促進清除胞外病原體的入侵和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用[8-9]。為了進一步探索Th17、Treg細胞在EBV兒童中表達的機制，本研究通過對我院EBV感染及健康體檢兒童檢測EB病毒抗體及EB病毒DNA，統(tǒng)計陽性患兒，分離出外周血T淋巴細胞，進一步采用流式細胞術及ELISA，檢測EBV患兒、健康兒童外周血T淋巴細胞中Th17、Treg細胞及其相關特征性細胞因子(IL-17、TGF-β)的水平變化，旨在從分子學水平，對EBV的臨床診斷、研究、治療提供進一步的免疫學支持。從而進一步揭示EBV免疫逃避的形成機制，給兒童EBV的預防及疫苗的開發(fā)提供新的思路與方法。

1 資料及方法

1.1 一般資料選取秦皇島市第一醫(yī)院2019年12月至2020年8月兒科門診及病房就診(復診)的66例EB病毒感染患兒作為觀察組，其中男39例，女27例；年齡6個月-14歲，平均(5.34±0.32)歲；血清EB病毒DNA拷貝數(shù)為4.5-6.8×105拷貝數(shù)/mL。另外選取同期于我院參加體檢的健康兒童60例作為對照組，其中男34例，女26例；年齡1-13歲，平均(5.50±0.38)歲。觀察組患兒中，初治組8例，緩解組58例。對照組與觀察組在性別、年齡方面的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 患兒入選標準包括：(1)年齡6個月-14歲；(2)所有EB病毒感染患兒診斷均符合胡亞美等編著的《諸福棠實用兒科學》中的相關標準；(3)包括首發(fā)和復發(fā)的EB病毒感染患兒；(4)智力正常，無精神類疾病，排除特殊遺傳代謝性疾病、血液系統(tǒng)及腫瘤疾??；(5)均依據(jù)倫理學原則征得家長及患兒同意，愿意配合本調查。

1.3 實驗方法

1.3.1Th17、Treg細胞及其相關特征性細胞因子(IL-17、TGF-β)檢測 首先抽取對照組與觀察組兒童肘靜脈血2.0 mL，將外周血T淋巴細胞加以分離。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA) 和熒光定量PCR 方法檢測EB病毒抗體及EB病毒DNA，分析陽性感染率。進一步采用流式細胞術及ELISA，檢測外周血T淋巴細胞中Th17、Treg細胞及其相關特征性細胞因子(IL-17、TGF-β)的水平變化，對其進行分析、總結。

1.3.2外周血Foxp3 mRNA表達的檢測方法 外周血淋巴細胞采用淋巴細胞分離液進行分離，采用TRIZOL一步法將總RNA加以提取，采用RT-PCR法對Treg表達叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Forkhead pterygoid transcription factor，F(xiàn)oxp3)mRNA與Th17表達孤核受體(Nosoluclear receptor，RORγt)mRNA的表達水平進行檢測分析?；跇藴是€法對mRNA相對表達水平加以計算。

1.4 觀察指標比較對照組與觀察組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率；比較對照組與觀察組Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平；比較初治組與緩解組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計學分析處理，采用均數(shù)、標準差描述一般資料，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率對比觀察組外周血Treg細胞百分率顯著低于對照組(P<0.01)，觀察組外周血Th17細胞百分率顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率比較

2.2 兩組外周血Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平對比觀察組外周血Foxp3mRNA表達水平顯著小于對照組(P<0.01)，觀察組外周血RORγtmRNA表達水平顯著大于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組外周血Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平比較

2.3 初治組與緩解組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平對比緩解組外周血Treg細胞百分率、Foxp3mRNA表達水平均顯著高于初治組(P均<0.05)，緩解組外周血Th17細胞百分率、RORγtmRNA表達水平均分別顯著低于初治組(P均<0.01)，見表3。

表3 初治組與緩解組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表達水平比較

3 討論

EBV感染是目前兒科臨床最常見的感染性疾病之一。兒童中非腫瘤性EBV感染疾病嚴重破壞兒童免疫功能，從而危及患兒生命健康，其預后不良，病死率高[10]。專家提出，兒童EBV感染及相關嚴重疾病，必須要引起兒科醫(yī)師高度重視，進行臨床和實驗研究。

Th17、Treg細胞是目前國內外免疫學研究的熱點。研究表明，初始的CD4+T細胞在不同細胞因子的作用下，可以向不同的方向分化。Th17、Treg細胞是一種近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞新亞型。目前大量研究表明，它們不同于Th1和Th2細胞[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)人胸腺、扁桃體、淋巴結和外周血中對Th17、Treg細胞的檢測，證實Th17細胞可通過特征性分泌IL-17誘導粒細胞集落刺激因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子、前列腺素E2及其他一些炎癥因子的表達產生強烈的致炎效應，參與各種自身免疫病、器官移植排斥反應和寄生蟲感染等多種疾病的促炎癥反應[12]。而Treg細胞是通過表面膜分子Foxp3，與其他細胞直接接觸或分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β等方式，來抑制體內的CD4+T細胞等多種免疫細胞的活化和增殖。有研究表明，其平衡機制及其相關因子(Th17、TGF-β)的變化，在機體促進清除胞外病原體的入侵和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用[13-14]。目前和自身免疫性疾病、腫瘤、抑制免疫和寄生蟲感染性疾病的免疫調節(jié)密切相關。目前國內兒童EBV感染中，機體對EB病毒的細胞免疫和體液免疫特點、合發(fā)癥的發(fā)生率等還缺乏系統(tǒng)研究，需要多中心協(xié)作研究。因此，研究國內兒童EBV感染中Th17、Treg細胞及其相關因子(Th17、TGF-β)的變化具有重要意義。

本研究結果還顯示： 觀察組外周血Treg細胞百分率顯著低于對照組(P<0.01)，觀察組外周血Th17細胞百分率顯著高于對照組(P<0.01)；觀察組外周血Foxp3mRNA表達水平顯著小于對照組(P<0.01)，觀察組外周血RORγtmRNA表達水平顯著大于對照組(P<0.01)。張茜等[15]研究發(fā)現(xiàn)：機體免疫反應之中，IL-6對Th17細胞以及Treg細胞之間的平衡性能夠有效調節(jié)，且該因子能夠決定初始CD4+T細胞的分化方向，對機體的免疫應答效應產生一定的影響。據(jù)此，可以推測在EBV感染疾病患者中，EBV靶細胞T淋巴細胞以及NK細胞等功能存在較大的缺陷，且會使得EBV清除過程受阻，某些細胞因子加快Th17細胞的增殖速度，引起炎性級聯(lián)擴大效應出現(xiàn)，Treg細胞增殖過程受到抑制，從而削弱了其抑制T淋巴細胞過度活化效果。上述結果就表明：Treg細胞所介導的免疫耐受在EBV感染的相關疾病的進展過程中扮演著十分重要的角色。此外，強化對外周血Treg細胞數(shù)及其相關炎性因子進行動態(tài)化監(jiān)測，能夠對EBV感染的相關性疾病的臨床治療效果進行準確地評估。

綜上所述，Treg/Th17細胞在EBV感染的相關疾病發(fā)病過程中扮演重要的角色，強化對患兒外周血Treg/Th17細胞水平的監(jiān)測，能夠為EBV感染相關性疾病病情及臨床治療效果評估提供重要依據(jù)。