張 眉 高小寬 紀(jì)君陽(yáng) 孫文文

（衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

黑斑病是影響我國(guó)梨產(chǎn)量及品質(zhì)的主要病害之一，鏈格孢菌是導(dǎo)致梨感染黑斑病的主要源頭[1]。梨樹早期落葉和嫩梢枯死都可能是梨黑斑病菌導(dǎo)致的，而且梨黑斑病的發(fā)生會(huì)讓果實(shí)提前掉落并且伴隨著裂果現(xiàn)象，嚴(yán)重削弱樹勢(shì)，降低樹體的生命力和抗病能力[2]。該病的潛伏侵染期在梨樹的花期和幼果期，涉及時(shí)間較長(zhǎng)，在果實(shí)的貯藏期間梨黑斑病仍存在并且不易控制和防范[3]。

近年防治梨黑斑病的研究很多，但是利用中藥提取物對(duì)梨生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行防治的做法很少，我國(guó)中草藥資源較豐富，中草藥中具有許多抗菌、抑菌、殺蟲作用的成分，這些成分是自然存在的，一般易于降解，對(duì)環(huán)境積蓄毒性的可能性不大[4，5]。本試驗(yàn)通過中藥提取物對(duì)梨葉片黑斑病病菌抑制效果進(jìn)行研究，采用離體葉盤法測(cè)定五味子提取物對(duì)梨黑斑病菌的抑制效果，從而篩選出五味子提取物對(duì)梨葉片黑斑病抑制的最佳濃度及梨葉片最佳浸液時(shí)間，以此為五味子提取物防治梨葉片黑斑病提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為新型生物防治劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料制備

1.1.1 病原菌制備。采集患有梨黑斑病的病葉，用70%酒精進(jìn)行表面擦拭消毒，無(wú)菌水沖洗后切取病健交界處組織，在無(wú)菌操作條件下移置到PDA平板上，于25℃保溫培養(yǎng)，表面長(zhǎng)出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上作為供試菌株在冰箱中保存待用。

1.1.2 五味子中藥粗提取。分別對(duì)五味子葉進(jìn)行粉碎，用80%乙醇進(jìn)行提取，在搖床中以150 rpm，25℃振蕩2 d，用離心機(jī)以3 500 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后用80%乙醇定容，最后將定容好的提取物容器進(jìn)行編號(hào)放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的制備。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無(wú)菌水1 000 ml，煮沸30 min。將紗布對(duì)折用于濾去馬鈴薯殘?jiān)?，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20 g，邊加邊攪拌防止糊化，將瓊脂加熱熔化后加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的無(wú)菌水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1 000 ml。分裝至250 ml三角瓶中，每瓶100 ml，包裝完成后，在0.103 Mpa、121℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 病原菌的擴(kuò)大化培養(yǎng)。取實(shí)驗(yàn)室冰箱保存菌種，在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。首先用經(jīng)滅菌的打孔器于菌板約2/3直徑處鉆取菌餅，將鉆取的菌餅用接種針轉(zhuǎn)移到PDA平板中心處，菌面朝下。置于光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)期間要定時(shí)觀察，將有雜菌感染的平板進(jìn)行處理，等待梨黑斑病菌菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 離體抑菌試驗(yàn)。首先配制所需濃度溶液，配制的五味子葉片提取物質(zhì)量濃度分別為50mg/L、100mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、1 500 mg/L、2000 mg/L、4 000 mg/L，將配制好的五味子葉提取物溶液放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用離體葉盤法測(cè)定梨黑斑病菌對(duì)五味子葉提取物的敏感性。從衡水學(xué)院校園采集葉齡相同的梨健康葉片，用自來水沖洗晾干，葉片正面朝上浸泡于上述不同處理藥液及對(duì)照組中，每種處理液及對(duì)照按照0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h的不同時(shí)間浸泡，然后將葉盤上的藥液用吸水紙吸干，葉背面朝上置于底部墊有用相同藥液潤(rùn)濕的托盤內(nèi)，每個(gè)葉盤上接種2個(gè)菌餅，每個(gè)處理3次重復(fù)，最后把托盤用保鮮膜罩好，保持濕潤(rùn)狀態(tài)。設(shè)置對(duì)照。培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果。菌落生長(zhǎng)直徑采用十字交叉法測(cè)量，根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行抑制率的計(jì)算。

1.2.4 離體抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。菌絲生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件求出藥劑毒力回歸方程和EC50值。

1.3 發(fā)病情況調(diào)查。接種7 d后，根據(jù)葉盤發(fā)病面積，采用9級(jí)法記錄病情。0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的5.1%～25.0%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的25.1%～50.0%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的50.1%～75.0%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的75.1%以上。根據(jù)下式計(jì)算各處理的病情指數(shù)。病情指數(shù)=Σ(各級(jí)發(fā)病葉盤數(shù)×相對(duì)極值)/(調(diào)查總?cè)~盤數(shù)×9)；防治效果=[1-(處理葉盤病情指數(shù)/對(duì)照葉盤病情指數(shù))]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度及時(shí)間對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。不同濃度及時(shí)間對(duì)梨黑斑病菌的影響如表1所示，梨葉片浸液0.5 h時(shí)，在濃度為50 mg/L時(shí)抑制率極低，幾乎沒有抑制效果，但是隨著濃度的升高抑制率隨之升高，在各個(gè)濃度梯度之間，抑制率差異不顯著。葉片浸液3 h、4 h時(shí)，在濃度為2 000 mg/L時(shí)抑制效果均最好，抑制率分別為49.04%、48.05%。葉片在不同濃度下的抑制率是隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)而增加，當(dāng)浸泡時(shí)間增至3 h時(shí)，無(wú)論哪個(gè)濃度藥劑，抑制率均達(dá)到最高值。因而可得出，梨葉片在五味子提取液下最佳浸液時(shí)間及最佳濃度分別為3h、2000mg/L。

表1 不同濃度及時(shí)間對(duì)梨黑斑病菌的抑制率影響

2.2 藥液對(duì)梨黑斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定。不同濃度藥液及浸泡時(shí)間對(duì)梨葉黑斑病影響的相關(guān)毒力回歸方程及EC50值、相關(guān)系數(shù)如表2所示。由數(shù)據(jù)可得，每個(gè)毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.916 683 443，說明離體葉盤保濕法具有較高的精密度。葉片浸液3 h的抑制作用最好，毒力最強(qiáng)，EC50為3 482.454 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.982 320 364。

表2 不同濃度藥液浸泡時(shí)間對(duì)梨黑斑病菌的毒力測(cè)定結(jié)果

2.3 病情記錄。通過9級(jí)法記錄病情，病斑級(jí)數(shù)及患病葉盤數(shù)情況見表3，由數(shù)據(jù)得出，梨葉的病情指數(shù)均分布在1級(jí)和3級(jí)，病斑級(jí)數(shù)越大就證明梨葉受梨黑斑病菌的侵染越嚴(yán)重，在梨葉浸泡時(shí)間為4 h之前，隨著浸液時(shí)間的延長(zhǎng)，梨葉病斑級(jí)別為1級(jí)的葉盤數(shù)也在增長(zhǎng)，這就代表著浸液時(shí)間的延長(zhǎng)抑制了梨葉片上病斑的擴(kuò)大，并且此現(xiàn)象跟抑菌效果有一定的聯(lián)系，在葉片浸液時(shí)間為4 h時(shí)，其1級(jí)葉盤數(shù)量有所下降，3級(jí)葉盤數(shù)量增加。由此可得，在葉片浸泡時(shí)間為3 h時(shí)，抑菌效果最佳。

表3 使用9級(jí)法記錄病情

2.4 病情指數(shù)及防治效果。由9級(jí)法得出的各級(jí)病斑，計(jì)算出各個(gè)時(shí)間段的處理葉盤病情指數(shù)及防治效果，如表4所示，葉片浸泡在對(duì)照組時(shí)，病情指數(shù)為33.33%，在葉片浸泡3 h時(shí)病情指數(shù)為最小值18.51%，較對(duì)照的病情指數(shù)下降了14.82%，并且防治效果最好，達(dá)到了44.4%，由此可看出，梨葉片浸液時(shí)間為3h時(shí)對(duì)梨葉期的梨黑斑病防治效果達(dá)到最佳。

表4 不同浸液時(shí)間的病情指數(shù)及防治效果

3 結(jié)論

在梨黑斑病菌對(duì)五味子提取物的敏感性測(cè)定試驗(yàn)中，得出梨葉片在五味子提取物中的最佳浸液時(shí)間及藥劑最佳濃度分別為3 h、2 000 mg/L。