岳顯文，鮑慧瑋，朱躍亞，曹 原，徐 陽(yáng)*

（1.白城醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)院，白城137000；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春130117；3.吉林省藍(lán)浦浩業(yè)科技有限公司，長(zhǎng)春130000）

防風(fēng)Sapos hnikovia divaricate（Turcz.）Schischk.為傘形科植物防風(fēng)的干燥根[1]，別名旁風(fēng)、東防風(fēng)[2]。防風(fēng)在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，主治外感風(fēng)寒、頭痛目眩、周身疼痛、骨節(jié)疼痛、風(fēng)寒濕痹等證[3]；明代李時(shí)珍在《本草綱目》中稱(chēng)，“防風(fēng)，可治男子一切勞傷，補(bǔ)中益神”。

防風(fēng)是傳統(tǒng)的辛溫解表藥[4]，防風(fēng)中化學(xué)成分較多，其中色原酮類(lèi)化合物是活性較明確的物質(zhì)，包括升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等，除此之外還有多糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、香豆素類(lèi)等物質(zhì)[5-6]。有研究指出，防風(fēng)中的色原酮類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[7-8]。因此，本文建立一種同時(shí)測(cè)定防風(fēng)中升麻素、升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的HPLC方法，并對(duì)白城產(chǎn)方法中3種活性成分含量的進(jìn)行測(cè)定，可作為防風(fēng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

華譜S3000高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器（華譜科儀（北京）科技有限公司）；DFY-500型多功能高速中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）。

1.2 試藥

防風(fēng)采集于白城和內(nèi)蒙古地區(qū)，由白城醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校中藥學(xué)岳顯文副教授鑒定為百合科虎眼萬(wàn)年青屬多年生草本植物虎眼萬(wàn)年青Ornithogalum caudatum Jacq.。

升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（批號(hào)：111710-200602，111522-201913，111523-201811，含量為91.7%，94.6%，97.4%，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈股份有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液配制

分別取升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成濃度分別為1.164、2.501和1.817mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密移取上述3種溶液各0.4、1.0和1.0mL，置同一10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度分別為46.56、250.1、181.7μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1mL，用甲醇稀釋10倍，得到混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液配制

取本品細(xì)粉約0.25g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇10mL，稱(chēng)定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

AlltimaTMC18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)?~5min，40%A；5~20min，40%→50%A；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。由圖1結(jié)果表明，待測(cè)成分色譜峰均達(dá)到基本分離，理論塔板數(shù)均大于2000。

圖1 防風(fēng)混合對(duì)照品（A）和供試品（B）的HPLC圖譜

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到6個(gè)不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液。依法進(jìn)行分析，以對(duì)照品濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸。計(jì)算得出升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的線性回歸方程分 別 為Y=17.152X-1.691（r=0.9996）、Y=10.064X-12.773（r=0.9999）、Y=8.4517X+24.681（r=0.9995），表明升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度分別在0.9312~46.56μg/mL、5.002~250.1μg/mL、3.634~181.7μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取配置好的防風(fēng)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)針6次，測(cè)得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD值分別為1.03%、0.45%和0.78%，表明該儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配置好的防風(fēng)供試品溶液，放置室溫，分別于0、2、4、8、12、24h注入高效液相色譜儀中檢測(cè)，測(cè)得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD值分別為0.96%、0.25%和0.21%，表明防風(fēng)供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取防風(fēng)樣品（批號(hào)：20200601）6份，粉碎，每份取細(xì)粉約0.25g，按照“2.1.2供試品溶液配制”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為0.020%、0.134%和0.114%，RSD值分別為1.33%、1.56%和1.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已經(jīng)測(cè)得含有量的防風(fēng)樣品6份，粉碎，每份稱(chēng)取約0.125g，精確稱(chēng)量，再加入升麻素對(duì)照品溶液（25.05μg/mL）0.05mL、升麻素苷對(duì)照品溶液（167.3μg/mL）0.1mL和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液（142.0μg/mL）0.1mL，置同一帶塞錐形瓶中，按照“2.1.2供試品溶液配制”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 防風(fēng)樣品中3種活性成分的含量測(cè)定

取白城產(chǎn)地防風(fēng)樣品，按照“2.1.2供試品溶液配制”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2色譜條件”下進(jìn)樣分析，計(jì)算防風(fēng)樣品中升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷3種活性成分含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白城和內(nèi)蒙古防風(fēng)三種成分含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論與結(jié)論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用的DAD檢測(cè)器，參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，同時(shí)考察了防風(fēng)供試品溶液在210、238、254、322nm等多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷3種待測(cè)成分的吸收情況，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm時(shí)，待測(cè)成分色譜峰吸收最好，且基線平穩(wěn)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部“防風(fēng)”含量測(cè)定項(xiàng)下的方法[1、12]，以甲醇∶水（40∶60）為流動(dòng)相，三者保留時(shí)間均適中，但是測(cè)定樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)色譜圖中3種待測(cè)成分色譜峰分離度不夠，所以改用梯度洗脫（0~5min，40%A；5~20min，40%→50%A），待測(cè)成分色譜峰與其他成分色譜峰分離度較好，且峰形較對(duì)稱(chēng)。

3.3 柱溫的選擇

色譜柱的柱溫能直接影響分離效能和分析速度。一般的選擇原則是在使最難分離的組分有盡可能好的分離前提下，采取適當(dāng)?shù)偷闹鶞?，以保留時(shí)間適宜、峰形不拖尾為宜[13-14]。故本文選擇色譜柱的柱溫為30℃。

3.4 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，所收集的白城產(chǎn)防風(fēng)樣品中升麻素、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷3種成分含量均符合2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，并對(duì)比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，確定白城產(chǎn)防風(fēng)的質(zhì)量較優(yōu)，此環(huán)境種植的防風(fēng)藥材較高。