張燕妮，楊雨涵，辛 陽，李雙全，鞠會(huì)艷*

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院·吉林長春·130062）

在微生物相關(guān)研究工作中，菌種的保存是十分重要的。每株菌種性質(zhì)不一樣，在利用土壤微生物進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，能從土壤中分離出一些有意義的菌種，但接種到平板上的菌株在4℃低溫條件下也僅能保存數(shù)天，并且多次接種后菌株性質(zhì)也會(huì)發(fā)生一些變化，故應(yīng)當(dāng)對(duì)菌株進(jìn)行長期保存以便今后更有效地分析菌株的生理生化性質(zhì)和實(shí)踐應(yīng)用意義。本研究探索了幾種菌種的保存方法，并比較了這幾種方法的優(yōu)劣[1-3]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品

2020年從白城市通榆縣新華鎮(zhèn)永安屯A、B、C和D不同地點(diǎn)采取一定土壤樣品。這幾個(gè)地點(diǎn)位于東經(jīng)123°1′、北緯44°47′、海拔153.0m、氣壓995.0hPa。這8個(gè)地點(diǎn)的土壤屬于pH 8.60的鹽堿土。

1.1.2 菌株來源

從采取的鹽堿土中分離純化得到9種菌株。其中4種真菌中Y8和C4-3通過了12%氯化鈉的鹽篩，Y10、Y11通過了16%氯化鈉的鹽篩；2種細(xì)菌D4-1、X10和3種放線菌X12、ⅠB、Ⅲ18均通過了12%氯化鈉的鹽篩。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和儀器

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基[2]、6mm正方形濾紙片、凍存管、10%甘油、30%甘油生理鹽水（15mL甘油+氯化鈉0.45g+蒸餾水至50mL）、1.5mL EP管、移液器、恒溫培養(yǎng)箱、4℃冰箱、-20℃冷凍柜、-80℃冷凍冰箱。

1.2 保存方法

1.2.1 PDA生長菌株保存[4,5]

A：濾紙片保存法（-20℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，用無菌小鑷子夾住滅菌濾紙片（9片濾紙片）放入平板中接種的菌周圍（詳見圖1），等待菌絲長至濾紙片上后，可用無菌小鑷子將其小心放入凍存管中。每個(gè)凍存管放3片，為3個(gè)重復(fù)，旋緊蓋子后做好標(biāo)注放入-20℃冰箱冷凍保存。

圖1 放入濾紙片之后等待長滿菌絲的5個(gè)平板Fig.1.Five plates waiting to be covered with hyphae after inserting the filter paper

B：冷凍管保存法（-80℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~5天后,向1.5 mL EP管中加入1.2mL滅菌過的10%甘油，用接種環(huán)從菌株生長良好的PDA平板上刮取適量菌絲轉(zhuǎn)移到EP管中，每個(gè)菌種保存3份，做好標(biāo)注后置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.2.2 LB生長菌株保存[6]

A：斜面保藏法(4℃保存)：將滅好菌的LB固體培養(yǎng)基趁熱吸取800μL裝進(jìn)1.5mL EP管等待凝固，將分離得到的菌株接種到LB斜面上，在25℃培養(yǎng)3~5天，直到菌株長滿斜面，然后向試管中加入經(jīng)滅菌的10%甘油350μL，做3個(gè)重復(fù)，置于4℃冰箱保存。

B：菌液保存法（-20℃保存）：將所收集的菌種分別接種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~5天后。吸取2mL高壓滅菌的30%甘油生理鹽水（15mL甘油+氯化鈉0.45g+蒸餾水至50mL）洗下平板里的菌苔,吸取1.2 mL菌液加入高壓滅菌的潔凈1.5mL EP管中,最后放入-20℃冷凍柜中保存。

2021年1 月初至3月中旬，保存時(shí)間兩個(gè)多月。

1.3 活化

1.3.1 濾紙片保存菌種的活化-20℃保存的真菌用鑷子取出濾紙片置于PDA培養(yǎng)基上，倒置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 冷凍管保存菌種的活化

-80℃保存的真菌放置16h再進(jìn)行活化。另外一種方法是將-80℃保存的真菌直接吸取200μL再進(jìn)行涂板（PDA培養(yǎng)基），倒置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 斜面保存菌種的活化

4℃細(xì)菌、放線菌用接種環(huán)挑出小塊放進(jìn)LB培養(yǎng)基上，正置放入21℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 菌液保存菌種的活化

-20℃細(xì)菌、放線菌直接吸取200μL再進(jìn)行涂板（LB培養(yǎng)基），倒置放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存方法菌株的活化分析

2.1.1 PDA上生長的菌株

由圖2可見菌株活化后的生長情況，菌株活化涂板后生長基本遍布整個(gè)培養(yǎng)皿。濾紙片保存的菌株生長良好，應(yīng)用濾紙片保存的真菌全部生長，活化結(jié)果較好。但是應(yīng)用冷凍管保存的真菌中C4-3完全沒生長（圖2下排左邊第2個(gè)培養(yǎng)皿）。圖3可見濾紙片保存的C4-3菌株活化后在培養(yǎng)基上生長了（最右邊的培養(yǎng)皿），但冷凍管保存的C4-3菌株活化后沒有生長。

圖2 濾紙片保存（上5個(gè)）和冷凍管保存（下5個(gè)）Fig.2 Filter paper sheets(upper 5)and cryotube storage(lower 5)

圖3 C4-3的兩種保存Fig.3 Two kinds of preservation of C4-3

2.1.2 LB上生長的菌株

由圖4可見斜面保存法和菌液保存法的菌種活化后的生長情況，涂板后的菌基本長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，接種的菌株生長良好，活化結(jié)果很好。兩種存菌方法都比較成功。

圖4 細(xì)菌放線菌的斜面保存法（中間4個(gè)）和菌液保存法（左右各兩個(gè)）

3 小結(jié)

對(duì)于菌株保存方法的探索發(fā)現(xiàn)采用的四種不同保存方法均簡單易操作，對(duì)于真菌的保存建議應(yīng)用濾紙片保存法，以獲得更加穩(wěn)定的保存，而細(xì)菌、放線菌的保存則用斜面保存法和菌液保存法皆可。

至此，對(duì)于耐鹽細(xì)菌的存菌工作，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步的探索，以獲得更加穩(wěn)定有效的保存菌種方法，來保證菌株的穩(wěn)定性及活性。