鄧金生 鄧明玉 方岱溶 何秋星

五色梅全草提取液活性物以黃酮為主，在化妝品中具有許多優(yōu)良的性能。通過(guò)DPPH·抗氧化試驗(yàn)、MIC與抑菌圈抑菌試驗(yàn)及雞胚尿囊膜血管試驗(yàn)（HEA CAM）等探究其功效性。研究結(jié)果表明五色梅全草提取液的IC50 為0.3842mg/ mL;對(duì)大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為125mg/mL、62.5mg/mL 和125mg/mL，其抑菌圈大小分別為10.58mm、 10.20mm 和9.80mm。HEA-CAM試驗(yàn)中1mg/mL的五色梅提取液的刺激性評(píng)分IS為4.98，表明該提取液具有輕度眼刺激性。本試驗(yàn)為五色梅全草提取液在化妝品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

五色梅（ Lantana camara L.）又名臭草、馬纓丹，是馬鞭草科馬纓丹屬植物。五色梅分布廣泛，主要產(chǎn)于江西、浙江、湖南、廣西、廣東等地，以野生為主。研究資料顯示[1]，五色梅植株中主要的非揮發(fā)性化學(xué)成分是萜類，此外，還包括黃酮、呋喃萘醌、苯乙醇苷和酚酸類化合物等。

鄭達(dá)敏[2]等對(duì)五色梅進(jìn)行系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，包括五色梅的顯微結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、性狀等方面，為五色梅用藥方面提供一定依據(jù)。韋賢[3]等發(fā)現(xiàn)五色梅總黃酮可能通過(guò)改善炎性組織液中TNF-a、IL-1β 及抗氧化水平機(jī)制，而對(duì)Ⅱ型膠原導(dǎo)致的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行有效改善。盧衛(wèi)紅[4]等分離得到五色梅葉片中的屬青霉屬（Penicilliumsp）的內(nèi)生真菌，并且發(fā)現(xiàn)這種真菌的菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)液能夠抑制金黃色葡萄球菌。張偉[5]等對(duì)五色梅不同部位的總黃酮含量進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)五色梅的不同部位的總黃酮含量不同，且五色梅的乙醇提取液具有一定的抗氧化活性。由于五色梅具有多種生物活性，生長(zhǎng)力旺盛，容易存活，廉價(jià)易得，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

1.1原材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所使用的五色梅購(gòu)買于湖南省神農(nóng)本草藥業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)所使用儀器見(jiàn)表1。

1.2. 五色梅全草提取液的功效評(píng)價(jià)

1.2.1 五色梅全草提取液的提取工藝

（1）五色梅的預(yù)處理：將干的五色梅全草在60℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，經(jīng)研磨粉碎后得到五色梅粉末，將粉末于室溫下密封保存。

（2）提取：稱取1g 五色梅粉末，加入乙醇，用玻璃棒攪拌均勻，超聲提取一段時(shí)間，趁熱抽濾，定容至100 mL，備用。

1.2.2 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

稱取0.0039gDPPH，加65% 的乙醇溶解，定容備用;按照表2準(zhǔn)確吸取Ac、Ai、Aj三組反應(yīng)液于4mLEP管中。

混勻后，避光20min 進(jìn)行反應(yīng)，在波長(zhǎng)517nm 處測(cè)吸光度，按式-1計(jì)算清除率S。

清除率（%）= （1-（Ai-Aj）/Ac）*100%（式-1）

以提取液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖。線性擬合，根據(jù)擬合結(jié)果計(jì)算IC50

1.2.3 五色梅提取液的抑菌性能測(cè)試

①培菌與菌懸液制備

將銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的菌種接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基，痤瘡丙酸桿菌接種于腦一心浸液斜面培養(yǎng)基（BHI），用滅菌液體石蠟液封以達(dá)無(wú)氧環(huán)境，置于37℃C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～ 3天。

培菌完成后，用生理鹽水 3mL 分別洗出斜面上的菌苔，充分搖勻，制成一定濃度的細(xì)菌懸液，置于4℃冷藏貯放備用。

②最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

取1mL 濃縮到1g/mL 五色梅提取液（生藥量），加入到1mL 的液體培養(yǎng)基中，混合均勻，再?gòu)闹形?mL稀釋的提取液，加入到1mL的液體培養(yǎng)基中，以此類推，得到一系列不同濃度的五色梅提取液。

取0.1mL 含菌量約為108CFU/mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的菌懸液接種于含抑（抗）菌劑的液體培養(yǎng)基的試管中，制備試驗(yàn)組樣本，并設(shè)陰性對(duì)照管（卡松、培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照管和純培養(yǎng)基對(duì)照管（菌懸液、培養(yǎng)基）。

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照管有細(xì)菌混濁，陰性對(duì)照管無(wú)菌透明，試驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的最高稀釋度為該樣品對(duì)受試菌的 MIC。

③抑菌圈實(shí)驗(yàn)法

目前，抑菌圈試驗(yàn)的方法主要有：杯碟法、Kirby- Bauer 法（以下簡(jiǎn)稱K-B紙片擴(kuò)散法）、平板打孔法等。 K-B 紙片擴(kuò)散法可用于生長(zhǎng)快速的細(xì)菌。因此，[前后沒(méi)有必然因果聯(lián)系，聯(lián)系作者修改]綠膿桿菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗(yàn)采用 K-B 紙片法。其操作方法如下：

傾注20mL 左右平板培養(yǎng)基于已滅菌的平板中，水平靜置，等待凝固。在制備好的平板上接種0.1mL 菌懸液，涂布均勻后，將浸泡在lg（生藥量）/mL 五色梅提取液的滅菌濾紙片取出，放到培養(yǎng)基中，輕輕按壓，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻放置3 張紙片，并且在同一個(gè)平皿中，放置1片浸泡65% 乙醇的紙片，充當(dāng)溶劑對(duì)照。以浸泡生理鹽水的紙片設(shè)置空白對(duì)照組，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照是放置浸泡0.5%的卡松溶液的紙片。在37℃下，將培養(yǎng)基培養(yǎng) 18h，測(cè)定抑菌圈直徑，其結(jié)果見(jiàn)表3。

1.2.4 雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)（HET-CAM）

參照《化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)》（SN/T2329-2009） 進(jìn)行，試驗(yàn)采用反應(yīng)時(shí)間法。根據(jù)結(jié)果按式-1 計(jì)算刺激評(píng)分（IS）。

式2-6中：sec H為CAM首次出血的平均時(shí)間，單位是s（下同）;sec L為CAM出現(xiàn)血管融解的平均時(shí)間;sec C（凝血時(shí)間）是開(kāi)始觀察到CAM 出現(xiàn)凝血的平均時(shí)間。

2.結(jié)果與討論

2.1 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

五色梅總黃酮提取液的濃度對(duì)DPPH 自由基的清除率影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，濃度在0.10mg/MI～0.60mg/mL 時(shí)，五色梅提取液對(duì)DPPH 的清除率隨著五色梅濃度的增大而上升，且呈線性關(guān)系。其線性擬合方程為：y=1.5844x-0.1088，R2=0.99.38，由此可計(jì)算出五色梅的IC50為0.3842mg/mL。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，大腸艾希氏菌與表皮葡萄球菌的 MIC為125mg/mL，金黃色葡萄球菌的MIC為62.5mg/mL。說(shuō)明相比于大腸桿菌和表皮葡萄球菌，五色梅提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更強(qiáng)。1g/mL五色梅提取液（生藥量）對(duì)大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有一定的抑制作用。

2.3 刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用濃度為1mg/mL、10mg/mL 的五色梅提取液采用反應(yīng)時(shí)間法進(jìn)行試驗(yàn)。如圖2和表5所示，1mg/mL 五色梅提取液IS值為4.98，在1到5 之間，存在輕度的眼刺激性。10mg/mL 五色梅提取液IS 值為8.35，在5 到9 之間，存在中度的眼刺激性。

3.結(jié)論

本文通過(guò)DPPH自由基清除試驗(yàn)、MIC 試驗(yàn)、抑菌圈試驗(yàn)及雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)對(duì)五色梅全草提取液的功效進(jìn)行了探究。

五色梅提取液的體外抗氧化性能測(cè)試表明其對(duì)DPPH自由基IC50 為0.38mg/mL;對(duì)大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌均具有抑制作用，其中，大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC 分別為125mg/mL、62.5mg/mL及125mg/mL，其抑菌圈大小分別為10.58mm、10.20mm、9.80mm。HEA-CAM試驗(yàn)中1mg/mL 的五色梅提取液的刺激性評(píng)分IS 為4.98，表明該提取液有弱眼刺激性。

作者鄧金生和鄧明玉供職于廣州今盛美精細(xì)化工有限公司;方岱溶和何秋星供職于廣東藥科大學(xué)。

本項(xiàng)目受 2020年度省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助（項(xiàng)目編號(hào)： S202010573045）

參考文獻(xiàn)

[1]余細(xì)紅，向亞林.馬纓丹的綜合利用研究[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2012， 41（4）：83-87.

[2]鄭達(dá)敏，周寧.中藥五色梅的生藥學(xué)研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012.8（04）：16-17[3]韋賢，王金妮，李振中，等.五色梅總黃酮治療Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎及其機(jī)制[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34（02）：189-192.

[4] 盧衛(wèi)紅，洗瓊珍，朱峰.五色梅葉內(nèi)生真菌YJ-11的分離鑒定及其抑菌活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，20l3，52（24）：6048-6050.

[5] 張偉，吳靜姝，宋照風(fēng)，等.五色梅總黃酮含量測(cè)定與自由基清除活性分析[J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（21）：5227-5230.